黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞保护作用的研究※

马 萍 纪 中 戚汉平 曹永刚 黄 伟

（哈尔滨医科大学，黑龙江 大庆 163319）

心血管疾病的发病率逐年上升，已经成为继肿瘤之后威胁全人类健康的第二大疾患。其中因冠心病死亡的占其死亡总数的50%左右，且呈上升趋势，心肌梗死是冠心病中常见的严重类型。临床上寻找新的更有效、更安全、更经济的防治方法仍是研究的热点问题。黄芩苷具有抗氧化、抗炎、保护缺血后受损心肌细胞的作用，临床上已经广泛运用于各种心血管疾病的治疗。本课题旨在研究黄芩苷预处理对大鼠心肌的保护作用及其调控机制，为黄芩苷的开发研制及心肌梗死（AMI）的防治提供理论依据。

材料

1．药品及试剂：黄芩苷（嘉迪欧公司提供，批号：GDL20120224A），Bax及Bcl－2小鼠抗大鼠单克隆抗体（购于Abcam），GAPDH兔抗大鼠多克隆抗体（购于Santa Cruz），RNA试剂盒、荧光定量PCR试剂盒及引物设计（均为TaKaRa产品）。

2．动物与分组：30只健康Wistar大鼠（由哈尔滨医科大学动物中心提供），体重210～230g，随机分为三组，每组10只。假手术组（Sham）、心肌梗死模型组（简称心梗模型组）（MI）、黄芩苷组（BAI）。各组依次连续4周分别灌胃给药生理盐水、BAI 400mg/kg·d，末次给药30min后建立大鼠急性心肌梗死模型。

方法

1．心肌梗死模型的制备：Wistar大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，颈部至剑突去毛，分离气管，连接麻醉呼吸机，开胸后进行辅助呼吸。呼吸频率16～18次/min，吸气/呼气比为1∶2，潮气量350～550mL。连接心电图导联，分别为右上肢、左下肢、腹部（肢体Ⅱ导联），在大鼠胸骨左缘第3、4肋间开胸暴露心脏，轻压挤出心脏，5/0号细线结扎冠状动脉左前降支起始端，迅速将心脏放回胸腔，排出空气，闭胸[1]。假手术组只穿线不结扎。

2．Western blotting检测 Bax及 Bcl－2蛋白水平，提取心肌总蛋白，BCA－100法测定蛋白含量。取100μg等量蛋白经10%SDS－PAGE电泳后转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉封闭1h后分别与小鼠抗大鼠Bax、Bcl－2及兔抗大鼠GAPDH抗体（以TBS稀释，浓度分别为1∶500、1∶200）室温孵育2h；洗膜后与二抗（兔抗小鼠及山羊抗兔IgG）室温孵育1h，化学发光显影，凝胶成像系统拍照、扫描分析。以目的条带和GAPDH条带吸光度比值作为半定量结果。

3．荧光定量PCR半定量检测心肌肌钙蛋白（cTn－T）mRNA表达：提取心肌总RNA，计算RNA的纯度，进行逆转录反应（TaKaRa），合成的cDNA储存在－20℃条件下备用。以β－actin为内参照，引物如下：cTn－T上游5’－ACC TAT GCC GGC AGC TTC A－3’，下游5’－GAG AGT GGG CCG CTT AAA CTT G－3’，β－actin 上 游 5’－GCG AGA AGA TGA CCC AGA TC－3’，下 游 5’－CCA GTG GTA CGG CCA GAG G－3’。合成cDNA。定量PCR检测为20μL反应体系，反应液中包括 SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，PCR forward primer及PCR reverse primer各0．4μL，Rox Referance Dye 0．4μL，ddH2O 6．8μL，模 板cDNA 2μL。cTn－T及β－actin的PCR反应条件为95℃30s，1个循环，95℃10s、62℃31s45个循环。

4．标准曲线的制备，将PCR产物按照1/5倍浓度梯度进行稀释，选择10 000、2000、400、80、16、3．2浓度的稀释产物作为标准模板，进行荧光定量PCR反应。通过这6个标准品生成的反应数据，绘制标准曲线[2]。

结果

1．Western blotting检测 Bax及 Bcl－2蛋白水平，心梗模型组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达高于假手术组，差异有统计学意义（P＜0．05）；黄芩组大鼠心肌细胞Bax蛋白表达低于心梗模型组（P＜0．05）；心梗模型组大鼠心肌细胞Bcl－2蛋白表达低于假手术组，差异有统计学意义（P＜0．05）；黄芩苷组大鼠心肌细胞Bcl－2蛋白表达高于心梗模型组（P＜0．05）。见表1。

表1 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞Bax及Bcl－2蛋白表达的影响（±s）

表1 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞Bax及Bcl－2蛋白表达的影响（±s）

注：＊与心梗模型组比较，＊P＜0．05

分组 例数 Bax/GAPDH Bcl－2/GAPDH假手术组 10 0．6±0．082＊ 1．8±0．095＊心梗模型组 10 1．5±0．079 0．9±0．086黄芩苷组 10 0．8±0．094＊ 1．3±0．072＊

2．绘制标准曲线：以不同定量模板起始浓度的对数（lgC）为横坐标，以CT值为纵坐标，得到标准曲线，相关系数R2＝0．9968，符合要求。

3．实时荧光定量PCR测定结果：根据不同组中cTn－T的CT值，从标准曲线上计算出每组样品的浓度，进而计算出目标基因和内参基因浓度的比值。心梗模型组大鼠心肌细胞cTn－T mRNA表达明显低于假手术组（P＜0．01），黄芩苷组大鼠心肌细胞cTn－T mRNA表达高于心梗模型组，差异有统计学意义（P＜0．05），见表2。

表2 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞cTn－T mRNA表达的影响（±s）

表2 黄芩苷对心肌梗死大鼠心肌细胞cTn－T mRNA表达的影响（±s）

注：与心梗模型组比较，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

分组 例数 cTn－T/β－actin mRNA假手术组 10 2．43±0．95＊＊心梗模型组 10 0．63±0．26黄芩苷组 10 1．78±0．89＊

讨论

急性心肌梗死（AMI）是严重威胁人类生命的主要疾病之一。近年来研究发现，缺血、缺氧以及缺血再灌注过程中心肌细胞除发生坏死外，还可诱发和（或）启动心肌细胞凋亡。细胞凋亡受基因的调控，表现为凋亡信号通路的启动和相关基因的表达。在不同的因素刺激下，参与诱导心肌细胞凋亡的调控基因不尽相同。介导细胞凋亡的信号传导通路有多条，且它们之间存在相互联系。凋亡信号的刺激，一方面通过细胞内酶促级联反应，活化特异性核酸内切酶和转录因子，引起细胞发生凋亡的形态与生化改变；另一方面活化凋亡调控基因表达。

Bax是Bcl－2的同源体，可抑制Bcl－2的作用，促进细胞凋亡。本研究显示AMI后，心梗模型组大鼠心肌组织的Bax基因蛋白表达高于假手术组（P＜0．05）。Bax表达促进细胞凋亡可能通过以下几种机制实现：①Bax与Bcl－2形成异源二聚体，抑制Bcl－2作用，还可能抑制Bcl－2家族中如Bcl－xL等其他抑制凋亡基因的作用；②Bax/Bax同源二聚体的形成，抑制线粒体细胞色素C释放，促进细胞凋亡；③Bax本身具有促进细胞凋亡的作用。

Bcl－2家族是公认的凋亡抑制基因，可抑制多种因素如氧自由基和p53诱导的细胞凋亡，也可以减少缺血再灌注心肌细胞的凋亡。本实验结果显示，AMI后心肌组织的Bcl－2蛋白低于假手术组水平（P＜0．05）。提示Bcl－2对心肌细胞具有保护作用，诱导心肌细胞表达Bcl－2已成为探索心肌保护措施的新途径。

cTn－T存在于心肌细胞的细肌丝中，是心肌肌钙蛋白复合体中的一种多肽亚单位，分子量为37KD，cTn－T作为心肌细胞所特有的一种调钙蛋白，完全具有心肌组织特异性并具有高度敏感性，因此是评价心肌坏死的首选标志物[3]。本实验结果显示AMI后心梗模型组大鼠心肌细胞cTn－T mRNA表达明显低于假手术组（P＜0．01），提示心肌组织坏死。

黄芩苷属黄酮类，是从中药黄芩中提取的主要成分，黄芩苷的药理作用体现在很多方面，主要是抗氧化、清除自由基、抗炎、抗肿瘤、阻止钙离子通道、抑制醛糖还原酶、抗病毒、抗过敏等，并对免疫、心脑血管、消化、神经等系统具有保护作用。近年关于黄芩苷在心、脑血管系统作用的实验研究日益增多，Peng及其同事近期研究证实：口服黄芩苷能通过抗氧化机制有效保护心脏缺血性损伤。在一项体外研究中，黄芩苷预处理可通过抗炎机制减轻培养的大鼠心肌细胞凋亡[4]。在我们研究中在体预防给药后发现，黄芩苷组与心梗模型组相比，Bax蛋白表达降低（P＜0．05）、Bcl－2蛋白表达升高（P＜0．05）、cTn－T mRNA表达升高（P＜0．05）。提示黄芩苷可能通过上调cTn－T mRNA 表达，上调Bcl－2蛋白、下调Bax蛋白表达，从而抑制心梗后心肌细胞凋亡的发生，这应是其保护心肌细胞，防治心肌梗死的作用机制之一。

[1]李贻奎，赵乐，何萍，等 ．提高结扎冠状动脉在体大鼠心肌梗死模型制作速度和质量的研究[J]．中国中西医结合杂志，2012，32（7）：948－950．

[2]马萍，纪中，纪长伟，等 ．蓝莓花色苷预处理对心肌梗死大鼠的保护作用[J]．中国比较医学杂志，2013，23（6）：49－52．

[3]曾红莲，李露明，班正贺 ．心肌肌钙蛋白T检测对急性心肌梗死的诊断价值[J]．当代医学，2011，17（1）：29－30．

[4]Lin L，Wu XD，Davey AK，et a1．The anti－inflammatory effect of baicalin on hypoxia/reoxygenation and TNF－alpha induced injury in cultural rat cardiomyopathy[J]．Phytother Res，2010，24（3）：429－437 ．