自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的内质网应激途径

孙颖颖 王冀 严宇鹏 李莉 魏庆庆 胡罗文 李鸥

自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的内质网应激途径

孙颖颖 王冀 严宇鹏 李莉 魏庆庆 胡罗文 李鸥

作者单位：100028 北京市，煤炭总医院ICU

目的 探讨高血压左室肥厚致左室舒张功能障碍过程中是否存在内质网应激（ERS）介导的凋亡途径。方法 购买普通Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（8周龄）30只和自发性高血压大鼠（SHRs）（8周龄）30只。随机各取10只大鼠处死后保留心脏标本，余给予普通饲料分别喂养至16周、32周。应用超声心动图等技术判定各组大鼠左室肥厚程度及左室舒张功能。大鼠符合实验要求后全部处死，留取标本。行TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，分别用免疫组化法及免疫印迹检测GRP78、caspase-12蛋白的表达水平。结果SHRs心肌组织GRP78、Caspase-12的表达升高。结论 高血压左室肥厚致左室舒张功能障碍过程中可能与ERS相关的Caspase-12通路介导心肌细胞凋亡相关。

高血压； 凋亡； 内质网应激

高血压最终会导致心功能障碍，细胞凋亡是可能机制之一。研究已经证实，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是介导细胞凋亡的重要通路。本研究在自发性高血压大鼠动物模型基础上，观察ERS相关标志性因子的表达情况，以探讨其在高血压心肌损害中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验对象

1.1.1 实验动物 购买普通Wistar-Kyoto（WKY）大鼠（8周龄）30只和自发性高血压大鼠（SHRs）（8周龄）30只。随机各取10只大鼠处死后保留心脏标本，余给予普通饲料分别喂养至16周、32周。应用超声心动图等技术判定各组大鼠左室肥厚程度及左室舒张功能。大鼠符合实验要求后全部处死，留取标本。

1.1.2 试剂及药物

1.1.2.1 HE染色所需试剂 Harris苏木素、盐酸酒精、1%氨水返蓝、伊红染液、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇、二甲苯溶液、中性树胶等，均由西苑医院中心实验室提供。

1.1.2.2 TUNEL染色所需试剂 TUNEL染色试剂盒购自南京凯基生物公司，产品编号KGA 703。

1.1.2.3 免疫组化、免疫印迹所需试剂 ①抗羊GRP78多克隆抗体（SC-1611）：美国Santa Cruz公司产品。②抗大鼠Caspase-12单克隆抗体（SC-21747）：美国Santa Cruz公司产品。③辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠二抗：北京中杉金桥生物技术公司产品。④DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术公司产品。⑤预染蛋白marker（相对分子质量20～120 KD）：标定相对分子质量为 20 KD、26 KD、36 KD、47 KD、85 KD、118 KD，美国 Fermentas公司产品。⑥增强的化学发光试剂盒（ECL试剂盒）：Amersham Phamacia Biotech公司产品。

1.2 方法

1.2.1 收缩压的测定及大鼠左室重量指数（left ventricular mass index，LVMI）的比较 采用 RBP-1型大鼠无创尾动脉血压测定分析系统，测量大鼠安静、清醒状态下尾动脉收缩压，连测3次，取平均值。用分析天平称取左心室重量（LVM，包括室间隔），计算 LVMI。

LVMI=LVM（mg）/体重（BM，g）

1.2.2 超声心动图检查 M型超声测量室间隔（IVS）和左室后壁（LVPW）厚度，短轴缩短率（FS）及左室射血分数（LVEF）；脉冲多普勒频谱测定二尖瓣E波最大速度、A波最大速度、E/A比值；连续多普勒频谱测定等容舒张时间（IVRT）。

1.2.3 HE染色 切片经Harris苏木素浸染6 min左右，水洗2 min，1%的盐酸乙醇分化5 s，水洗，伊红染2 min，流水快速冲洗、脱水、透明、封片固定，光镜下观察心肌细胞形态。

1.2.4 TUNEL法检测凋亡细胞 切片经二甲苯及梯度乙醇脱蜡、复水后严格按照TUNEL试剂盒要求检测凋亡细胞。观察5个高倍视野，计数每高倍镜视野TUNEL“+”细胞核数目。

1.2.5 免疫组化法检测GPR78、caspase-12蛋白表达 石蜡切片脱蜡、水化后置于0.3%H2O2处理10 min，然后进行微波修复10～15 min；室温冷却30～40 min；PBS 洗 3～5 min×3；5%牛血清白蛋白封闭，室温孵育20 min；分别滴加GRP78多克隆抗体（1∶200稀释）、Caspase-12多克隆抗体（1∶100稀释）的一抗，同时作PBS对照，4℃过夜；冲洗后滴加1∶400的辣根过氧化物酶标记二抗，37℃孵育30 min；水洗、显色、苏木素复染后乙醇脱水封片。

1.2.6 免疫印迹检测GPR78、caspase-12蛋白表达 取左室组织，提取总蛋白，经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、转膜、蛋白印记、ECL显色等步骤，检测GRP78、Caspase-12的蛋白表达。

1.3 统计学方法 由SPSS 17.0统计软件包完成数据分析。计量资料以±s表示，两组均数间比较采用小样本t检验，多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血压监测及心脏重量与体重的比值 最终全部大鼠完成了实验。SHRs血压呈持续升高趋势。与同周龄的WKY大鼠相比，8周龄、16周龄、32周龄组SHRs的血压均显著升高（P＜0.05）。与同周龄的WKY大鼠相比，8周龄组SHRs的心脏重量与体重比值未见明显变化，16周龄和32周龄组SHRs的心脏重量与体重比值均明显增加（P＜0.05）。见图 1。

2.2 超声心动图检测 与WKY大鼠相比，SHRs的 IVS和 LVPW 均明显增加（P＜0.05）；SHRs的E/A比值显著增加（E/A＞2），提示SHRs大鼠的心脏舒张功能己明显受损。见表1。

2.3 HE染色 HE染色显示，对照组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀；8周龄组SHRs与对照组比较未见显著性变化，仍可见心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀；16周龄组SHRs心肌细胞肥大，细胞核出现增大、畸形等改变，肌纤维排列较紊乱；32周龄组SHRs可出现心肌细胞的变性，呈局灶性、片状坏死，心肌纤维粗大、断裂等，微血管管壁增厚，管腔狭小，管周纤维组织增多。

2.4 TUNEL染色 与同周龄的WKY大鼠相比，8周龄组SHRs的心肌细胞凋亡无明显增加；16周龄组SHRs的心肌细胞凋亡明显增加（P＜0.05）；32周龄组SHRs的心肌细胞凋亡显著增加（P＜0.01）。与8周龄组的SHRs相比，16、32周龄组SHRs心肌细胞凋亡均显著增加（P＜0.05，P＜0.01）。见图 2。

2.5 免疫组织化学检测

2.5.1 GRP78 对照组大鼠心肌组织内可见少量、分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒，主要定位于心肌细胞胞浆内。8周龄、16周龄、32周龄组SHRs与同周龄对照组大鼠相比较，胞浆内可见明显增多的浓密深棕色颗粒（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）。见图 3。

2.5.2 Caspase-12 8周龄组SHRs及对照组大鼠心肌组织内可见少量、分布均匀、稀疏的浅棕色颗粒，主要定位于心肌胞浆内。与同周龄的WKY大鼠相比，16周龄、32周龄组SHRs的心肌细胞胞浆内可见明显增多的浓密深棕色颗粒（P＜0.01）。见图4。

2.6 免疫印迹检测

2.6.1 GRP78 与同周龄的WKY大鼠相比，8周龄组SHRs心肌组织的GRP78蛋白表达明显增加（P＜0.05）；16周龄组和32周龄组SHRs心肌组织的GRP78蛋白表达显著增加（P＜0.01），见图5。

2.6.2 Caspase-12 与同周龄的WKY大鼠相比，8周龄组SHRs心肌蛋白的Caspase-12蛋白表达无明显增加；16周龄组、32周龄组SHRs的心肌组织的Caspase-12蛋白表达显著增加（P＜0.01），见图 5。

3 讨论

高血压时大量心肌细胞的凋亡可使心肌细胞减少、室壁变薄，导致左心室几何形状改变并伴随着Ⅰ型胶原的生成及局部间质组织的增生，成为导致心功能障碍的重要因素之一[1]。本研究发现，高血压组大鼠的心肌细胞中，可见明显增加的凋亡细胞，同时GRP78表达水平升高，而GRP78表达的上调是目前公认的ERS激活的标志[2,3]，提示ERS介导了高血压所致的心肌细胞凋亡。ERS引起的细胞凋亡不同于线粒体细胞凋亡，它有一套自身的信号传递通路，即ERAD途径。ERAD途径包含ERS诱导 CHOP/GADD153 表达[4]、JNK 的活化[5]和 Caspase-12蛋白水解酶的活化[6]。Caspase-12定位于ER外膜，是介导ERS凋亡的关键分子，在死亡受体或线粒体凋亡途径中不被活化[7]。研究表明，Caspase-12与ERS介导凋亡的机制有关，而与非ERS介导的凋亡无关。Caspase-12与其他的Caspases一样以无活性的酶原形式存在。ERS引起Caspase-12激活，激活的Caspase-12与另外的ERS分子协同使Caspase-9激活，活化Caspase-9裂解Caspase-3酶原等效应Caspase，效应Caspase切割多ADP聚合酶和多种其他细胞内的底物，最终导致细胞凋亡。Caspase-12对Caspase-9的激活不依赖线粒体凋亡途径成分Apaf-1和Cyt C。

在我们的研究中发现，8周龄的SHRs与同周龄的WKY大鼠相比，未见明显增多的凋亡细胞。我们推测，在高血压的初期阶段，血压增高及其他因素的影响只是引起了UPR。UPR的启动在早期是发挥一种保护作用，使大部分蛋白质合成停滞，减轻内质网负荷。通过加速内质网伴侣基因、蛋白水平的高表达，如 GRP78/Bip，Calnexin，GRP94 等，以协助蛋白质折叠，发生内质网相关降解，清除不能正确折叠的蛋白质。这种保护性机制很快阻止了新生蛋白向内质网腔的转运，抑制了内质网的负荷过重，从而积极重建细胞内稳态。但当应激原强度超过细胞自身处理能力时，保护机制不能与损伤抗衡，ERS则以凋亡的方式引发细胞死亡。因此，在16周龄和32周龄的SHRs的心肌细胞中，可见明显增加的凋亡细胞，同时Caspase-12凋亡通路被激活。我们推测高血压状态下可能存在以下诱导ERS的因素：①血压的升高。动脉血压长期增高是平滑肌及心肌细胞凋亡的有效刺激[8]，且高血压动物主动脉平滑肌细胞对于转化生长因子2β、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）等凋亡刺激的反应性明显增加[9]。②钙离子失衡。细胞内Ca2+主要贮存于SR，其水平受SR钙离子转运蛋白如SR钙泵（SERCA）等调控。释放于肌浆内的Ca2+在SERCA的调控下逆浓度差而进入SR。因此，当SERCA活性发生异常改变时，必然引致细胞内Ca2+稳态失衡，从而促进或抑制细胞增殖与细胞凋亡的过程。已有研究发现，在高血压左心室肥厚过程中，SERCA活性显著降低，与心肌细胞凋亡指数（cardiac myocyte apoptosis index，CMAI） 和 LVMI 呈显著负相关。这可能是由于细胞浆内游离Ca2+向SR内泵入减少，造成胞内［Ca2+］i过度升高，直接诱导心肌细胞凋亡，最终导致左心室肥厚的发生[9]。③AngⅡ。AngⅡ能激活心肌细胞核内Ca2+依赖的DNA酶活性，导致DNA裂解、细胞凋亡[10]。与WKY大鼠相比，AngⅡ在SHRs中更容易诱发心肌细胞的凋亡，而且凋亡程度与Bax的表达和Caspase-3的活性相关。因此，AngⅡ水平的升高极可能会导致内质网内调控细胞凋亡的靶点活化从而激活ERS。

表1 实验期间各组大鼠常规超声心动图指标比较（±s）

表1 实验期间各组大鼠常规超声心动图指标比较（±s）

注：与WKY大鼠比较，aP＜0.05

组别 室间隔厚度（mm） 左室后壁厚度（mm） E/A 8周 16周 32周 8周 16周 32周 8周 16周 32周WKY 大鼠 2.10±0.04 2.25±0.05 2.34±0.49 1.70±0.07 1.80±0.07 2.00±0.09 1.57±0.11 1.65±0.09 1.42±0.68 SHRs 1.97±0.06 2.64±0.91a 2.78±0.08a 2.40±0.16a 2.40±0.24a 2.62±0.11a 1.49±0.06 1.38±0.04 2.46±0.20a组别等容舒张时间（ms） 短轴缩短率（%） 射血分数（%）8周 16周 32周 8周 16周 32周 8周 16周 32周WKY 大鼠 24.95±0.53 26.45±0.90 28.42±0.70 47.39±0.84 48.77±0.50 49.03±0.70 71.44±0.76 72.43±1.00 72.87±1.10 SHRs 25.26±0.60 31.79±0.94a 29.94±0.69 47.18±0.70 48.12±0.89 48.85±0.84 71.58±0.80 72.59±0.79 71.77±1.02

总之，三条ERS相关凋亡通路在细胞凋亡发生过程中并非同时激活，每条通路激活与ERS的诱发因素、细胞类型和细胞状态等都有关系。在本研究中，我们选取了GRP78、Caspase-12作为ERS的标志性因子，其中GRP78表达增高已被广泛认为是UPR启动的标志，而 Caspase-12则是ERS促凋亡途径的特有产物。本研究发现，SHRs大鼠心脏内ERS的标志性因子GRP78、Caspase-12蛋白水平表达均明显升高。结合ERS在其他细胞中的促凋亡作用，提示ERS导致了SHRs大鼠的心肌细胞凋亡，从而在高血压所致的左室肥厚到左室舒张功能障碍的发生发展中起到重要作用。

图1 实验期间各组大鼠血压、LVMI比较

图2 实验期间各组大鼠心肌组织TUNEL法检测凋亡细胞

图3 实验期间各组大鼠心肌组织免疫组化法检测GPR78蛋白表达

图4 实验期间各组大鼠心肌组织免疫组化法检测caspase-12蛋白表达

图5 实验期间各组大鼠心肌组织免疫印迹法检测GPR78、Caspase-12蛋白表达

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Endoplasmic reticulum stress pathway involved in myocardial apoptosis in spontaneously hypertensive rats

SUN Ying-ying，WANG Ji，YAN Yü-peng，et al.Department of ICU，China MeiTan General Hospital，Beijing 100028，China

Objective Endoplasmic reticulum（ER）stress is one of the intrinsic apoptosis pathways and apoptosis occurs in the critical organ in hypertension.However，the mechanisms by which ER stress lead to apoptosis remain enigmatic，particularly in the progression from cardiac hypertrophy to diastolic heart failure resulting from hypertension.Methods We used spontaneously hypertensive rats（SHRs） to investigate possible signaling pathways for ER stress.Results We found that the protein level of glucose regulated protein 78 were upregulated，and the caspase-12 dependent pathways was activated.Conclusion These results suggest that ER stress can con－tribute to myocardial apoptosis during this progression.

Hypertension； Apoptosis； Endoplasmic reticulum stress

10．3969/j．issn．1672－5301．2015．09．022

Q95-33；R544.1

A

1672-5301（2015）09-0855-04

2015-04-22）