MiR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表达及抗凋亡作用

郑华峰 陶晶 张斌 王纯 吴淳

MiR-126在大鼠心肌缺血再灌注早期的表达及抗凋亡作用

郑华峰 陶晶 张斌 王纯 吴淳

目的 探讨miR-126在大鼠心肌缺血再灌注（I/R）早期的表达及抗凋亡作用。方法 48只SD大鼠随机分为假手术（Sham）、I/R 2 h、I/R 4 h、I/R 6 h组，每组12只大鼠，比较各组缺血区心肌细胞凋亡蛋白水平及miR-126表达水平。构建重组腺病毒rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126载体，24只SD大鼠随机分为：①I/R组：大鼠转染空白病毒后I/R 2 h；②I/R+miR-126组：大鼠转染 rAAV9-ZsGreen-premiR-126后I/R 2 h，再次比较各组缺血区心肌细胞凋亡蛋白水平。结果 与Sham组相比，I/R 2 h、4 h、6 h组大鼠心肌缺血区miR-126表达进行性降低（P<0.05），非缺血区miR-126表达进行性升高（P<0.05）；心肌凋亡蛋白BAX及CASPASE-3表达水平升高（P<0.05），抗凋亡蛋白BCL-2表达水平降低（P<0.05）。与I/R组相比，I/R+miR-126干预组心肌凋亡蛋白BAX及CASPASE-3表达水平明显减少，抗凋亡蛋白BCL-2表达水平增加（P<0.05）。结论 在I/R早期大鼠心肌缺血区miR-126表达随再灌注时间延长进行性下降，并伴随心肌细胞凋亡进展；过表达miR-126可减少I/R导致的心肌细胞凋亡，发挥保护心功能的作用。

miR-126；心肌缺血再灌注；心肌缺血区；凋亡蛋白；细胞凋亡

缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）损伤可以加重组织、器官的功能障碍和结构损伤。探索I/R损伤的机制，做到既能尽早恢复缺血组织的血流，又减轻或防止I/R损伤的发生，是包括冠心病在内的缺血性疾病治疗中急需解决的重要问题[1,2]。I/R损伤中细胞凋亡是最重要环节之一[3]。1994年Gottlieb等[4]首次报道在兔心肌I/R损伤模型中发现细胞凋亡；随后Fliss等[5]报道持续缺血过程存在细胞凋亡，但I/R过程中细胞凋亡尤为显著。细胞凋亡的水平一定程度上反映I/R损伤的严重程度，抑制I/R过程中细胞凋亡的发生发展，则可能防止或减轻I/R损伤的发生，从而为冠心病的治疗带来新的希望。MicroRNA（miRNA）分子是一类内源性、非编码、单链RNA，通过结合靶基因的mRNA的3非翻译区（3′-UTR），介导靶基因mRNA降解，抑制或增强其蛋白质翻译，从而调控转录后的基因表达[6-8]。目前研究已发现许多miRNAs参与细胞增殖、分化、发育及凋亡等复杂的生物进程[9-11]。 MiR-126是一种来源于Egfl7第7个内含子的保守型内含子miRNA，主要在哺乳动物的内皮细胞（endothelial cells，ECs）及浆细胞样树突状细胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）内表达，参与血管的生成及癌细胞的增殖和迁移[12-14]。Nazari-Jahantigh等[15]观察到大鼠缺血30 min再灌注4 h的心肌组织中miR-126表达下降。以上研究提示，miR-126在I/R早期心肌表达异常，并可能参与I/R过程中的细胞凋亡。

本研究以心肌I/R早期大鼠模型为研究对象，观察I/R早期心肌细胞中miR-126的表达变化及心肌细胞凋亡水平。进一步通过构建重组腺病毒rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126载体，过表达rniR-126表达后观察其对心肌细胞凋亡的影响，从而为临床I/R损伤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器总RNA提取试剂Trizol（Invitrogen，USA）、反转录试剂盒 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Ambion，Austin，TX），Quanti－Tect SYBR Green PCR Kit（Qiagen，German），QuantiTect SYBR Green PCR Kit（Takara，Japan），PCR扩增引物由Invitrogen广州公司合成，重组腺病毒rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126载体及空白对照病毒载体购自苏州吉玛公司，兔抗大鼠CASPASE-3、BAX、BCL-2及GAPDH单克隆抗体购自Abcam。普通 PCR 仪（BIO-RAD，USA），NanoDrop 2000c紫外 分 光 光 度 计（ThermoScientific，USA），LightCycler480荧光定量 PCR 仪（Roche，Germany）等。

1.2 实验动物及分组 SPF级雄性SD大鼠72只，体重220～250 g，由南京大学动物模式研究所提供并在该中心饲养。饲养环境为清洁级，温度维持在20℃～22℃。动物分笼饲养，每笼2只，饲以标准饲料，自由饮水，每周换塾料、消毒笼具2次。动物使用符合南京大学动物管理委员会管理条例。随机分组为（n=15）：①Sham组：SD大鼠仅开胸，不进行冠状动脉前降支结扎，6 h后处死；②I/R 2 h组：SD大鼠开胸并进行I/R，2 h后处死；③I/R 4 h组：SD大鼠开胸并进行I/R，4 h后处死；④I/R 6 h组：SD大鼠开胸并进行I/R，6 h后处死；⑤I/R组：大鼠转染空白病毒后I/R 2 h；⑥I/R+miR-126组：大鼠转染rAAV9-ZsGreen-premiR-126后I/R 2 h。

1.3 动物模型制备 参考文献建立心肌缺血再灌注模型[16,17]。行颈部正中切开术分离气管，插气管插管连接动物呼吸机（BL-420生物信号采集处理系统，成都泰盟科技有限公司），同时测定心率（HR）、心律和心电图（ECG）ST段。沿胸骨正中线切开皮肤，从胸骨左缘剪断第3、4两肋骨，用小开心器撑开切口，暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心房间找出左冠状动脉前降支，用无创缝合丝线置于左冠状动脉前降支起始部下2 mm处备用，将丝线两端套一小塑料垫片，再穿入一聚乙烯小管以形成环路，稳定10 min后轻轻抽紧丝线两端，推套管紧贴心壁以阻断左冠状动脉血流，以心电图Q导联上ST段弓背上抬 0.1 mV或T波高耸、心尖部心肌颜色变暗红色为完全结扎标志。

1.4 RNA提取步骤 在每1 ml Trizol试剂加入100 mg组织标本中，冰上充分裂解，移液枪轻轻吹打细胞。将裂解后的组织标本加入eppendorf管中，剧烈震荡30 s，静置5 min。加入氯仿0.2 ml，充分混匀后室温静置5 min。在4℃，以12 000 r/min离心15 min，吸去上清后转入新的eppendorf中，加入异丙醇0.5 ml，混勾后放置于4℃冰箱10 min，再次在4℃，12 000 r/min条件下离心10 min，去上清后留取沉淀。加入1 ml 75%已经预冷的乙醇，震荡洗涤沉淀RNA，12 000 r/min离心5 min，吸去上清后空气干燥10 min。加入4℃ DEPC水以充分溶解。

1.5 Quantitative real-time PCR（qRT-PCR）检测大鼠心肌 miR-126、Caspase-3、Bcl-2及 Bax的表达量 按照QuantiTect SYBR Green PCR Kit试剂盒说明书，以合成的cDNA作为模版在LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR反应。PCR反应体系为：模版cDNA 1 μl，miR-126特异性引物0.4 μl，10×miScript Universal Primer 2 μl，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，miR-126上游引物为 5′-TACCAAAAGTAATAATGTGCTG-3′，下游引物为Qiagen公司试剂盒提供的通用引物；以 U6为作为内参，U6上游引物为 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′， 下游 引 物 为 5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，加 RNase-free water 7.4 μl至总体积 20 μl。

按照SYBR premix Ex TaqTMⅡ PCR Kit试剂盒说明书，以合成的cDNA作为模版在LightCycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行RT-qPCR反应。普通基因反应体系为：模版 cDNA 1 μl，SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Mix 10 μl，正、反向引物（20 μmol） 共 1.6 μl，Caspase-3、Bcl-2 及 Bax 上下游引物见表1，加RNase-free water 7.4 μl至总体积20 μl。反应条件为：95 ℃ 30 s，随后 95 ℃ 5 s，55 ℃30 s，72℃ 15 s，共40个循环。采用 ΔΔCT分析方法计算qPCR仪所得数据[18]。

表1 基因引物信息

1.6 Western blot检测心肌细胞CASPASE-3、BAX及BCL-2蛋白的表达特征 配制组织裂解缓冲液［0.1 mol/L Tris Cl（pH 7.4），EDTA 1 mmol/L，1%的 Triton X-100，0.3 mol/L Aprotinin，1 mmol/L PMSF］。分别将液氮内冻存的各组心肌组织取出120～150 mg，在液氮内研磨成粉末后倒入一塑料管中，加入1 ml溶液悬浮，冰上匀浆3次，每次10 s，超声处理3次。13 000 r/min离心30 min，上清即为所需蛋白。蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳并转膜。蛋白转膜结束后，以5%脱脂奶粉TBS配制液封闭后，膜置于含兔抗大鼠CASPASE-3抗体（ab17815，1∶500 稀释）、BAX 抗体（ab32503，1∶1000稀释）及 BCL-2抗体（ab117115，1∶500稀释）溶液中，室温摇床反应 2 h，TBST［154 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris（pH 9.5），0.05%聚山梨酯］洗膜，并将膜置于相应二抗溶液中室温摇床反应2 h，用ECL试剂盒显色，X线胶片显影。用 NIH Image软件对X线胶片上阳性条带实施扫描，测定吸光度值。所有实验至少重复3次。

1.7 统计学方法 统计学分析采用SPSS 17.0。所有计量资料均以±s表示，不同实验组间比较采用两个样本独立t检验。结果判断以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缺血再灌注大鼠建模情况 左冠状动脉前降支结扎部位以下心肌颜色变苍白，搏动减弱，心电图ST段明显抬高（图1）。缺血45 min后解开活结，恢复前降支血流，30 min后可观察到室性早搏、室性心动过速、室颤等再灌注心律失常，发生率为72%。手术大鼠共72只，存活60只，存活率83%。死于心室颤动5只，死于心脏骤停3只，死于腹腔大出血2只，死于麻醉过量1只，死于术后急性左心衰1只。

2.2 I/R大鼠心肌不同区域miR-126表达特征采用qRT-PCR方法检测miR-126的表达，结果发现，在缺血区I/R 2 h、4 h、6 h组miR-126的表达分别为 Sham 组的（0.82±0.18）倍、（0.60±0.15）倍、（0.42±0.08）倍（P<0.05），见图 2A；在非缺血区则随着再灌注时间延长，miR-126表达逐渐升高，I/R 2 h、4 h、6 h miR-126的表达分别是Sham组的（1.38±0.14）倍、（1.89±0.15）倍、（2.43±0.25）倍，与 Sham 组比较差异有统计学意义（P<0.05），见图2B。上述结果提示，在心肌缺血区miR-126的表达量随时间依赖性降低，而非缺血区心肌miR-126的表达量随时间依赖性增加。

2.3 I/R大鼠心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3的表达特征 与Sham组比较，I/R 2 h、4 h、6 h后大鼠心肌缺血区Bcl-2 mRNA表达下调分别为（0.85±0.15）倍（P<0.05）、（0.65±0.11）倍（P<0.05）、（0.43±0.08）倍（P<0.05），见图 3A；Bax mRNA表达上调分别为（1.57±0.11）倍（P<0.05）、（2.46±0.24）倍（P<0.05）、（3.21±0.33）倍（P<0.05），见图3B；Caspase-3 mRNA表达上调分别为（1.31±0.08）倍（P<0.05）、（1.95±0.28）倍（P<0.05）、（2.78±0.38）倍（P<0.05），见图 3C。经 Western blot检测发现，I/R大鼠心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3蛋白的表达与mRNA一致，见图3D。

2.4 转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126前后大鼠心肌miR-126的特征 I/R组大鼠心肌组织检测到较低水平miR-126表达。与I/R组比较，转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126 14 d后心肌组织可观察到 miR-126的表达明显升高，见图4A。经qRT-PCR方法检测发现，转染 rAAV9-ZsGreenpre-miR-126后大鼠心肌miR-126的表达量为转染前的（12.21±0.58）倍，见图 4B。

2.5 I/R大鼠转染 rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126前后心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3的表达特征 与I/R组比较，转染rAAV9-ZsGreen-premiR-126后大鼠心肌缺血区Bcl-2 mRNA 水平表达增高为（2.67±0.38）倍（P<0.05），Bax mRNA 表达水平下调为（0.46±0.08）倍（P<0.05），Caspase-3 mRNA 表达 水 平 下 调 为（0.62±0.12）倍（P<0.05），见图 5A。经 Western blot检测发现，转染 rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126前后I/R大鼠心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3蛋白的表达与mRNA一致，见图5B。

3 讨论

文献报道I/R早期即可出现细胞凋亡，细胞凋亡是I/R损伤过程的重要环节。细胞凋亡的水平一定程度上反映I/R损伤的严重程度，因此抑制细胞凋亡的发生、发展，是减轻I/R损伤的重要手段。本研宄发现，Sham组大鼠心肌形态正常，结构清晰，心肌纤维排列整齐有序；而I/R处理后缺血区大鼠心肌组织细胞浆深染，细胞核不规则，炎性细胞浸润，且上述改变随再灌注时间延长而进展，而非缺血区组织形态未见异常改变，与文献报道一致。Caspase-3是经典的细胞凋亡的指标，当I/R发生时，细胞内凋亡相关信号转导系统传递信号，激活调控细胞凋亡的基因，细胞即按死亡程序自动走向死亡[19,20]。本研究发现，在缺血45 min再灌注2 h后即可观察到心肌缺血区有炎性细胞浸润，抑制凋亡作用的Bcl-2水平降低，促凋亡因子Caspase-3及Bax表达升高，提示I/R 2 h后即可出现细胞凋亡，且随再灌注时间延长Bcl-2水平进一步降低，Caspase-3及Bax水平进一步升高，提示再灌注时间延长缺血区细胞凋亡加重，而非缺血区再灌注未有明显细胞凋亡。

本研究以rAAV9为载体，ZsGreen为焚光标记，pre-miR-126为目的基因在体内转染大鼠心肌。实验观察到rAAV9转染后7 d左右miR-126开始表达，14 d为表达高峰，与文献[21]报道一致。本研究结果提示，rAAV9可以高效、稳定地在心肌表达，且作用安全。

前期研究报道miR-126在I/R损伤中表达异常。Tang等[22]观察到，在大鼠缺血30 min再灌注24 h心肌组织中miR-126表达下降。Ren等[23]则报道，小鼠缺血30 min再灌注24 h时miR-126表达则上调。本研究发现，大鼠缺血45 min再灌注心肌缺血区miR-126表达降低，且在2 h、4 h、6 h呈进行性下降，并伴随细胞凋亡进展。因此我们设想，I/R早期缺血区miR-126降低可能参与了细胞凋亡过程。MiR-126在肿瘤领域被广泛报道参与调节细胞凋亡，在肾脏的I/R研宄中也被报道参与调节细胞凋亡[24-26]。Dong等[27]观察到进行缺血预处理后，再结扎大鼠冠状动脉6 h，之前观察到梗死区miR-126降低的趋势得以改善，梗死区凋亡细胞减少，梗死区面积减少。Cheng等[28]报道将大鼠心肌缺血预适应处理后，心肌组织miR-126的表达增加，抑制miR-126表达后，缺血预适应的心肌保护作用减弱。上述研究一致发现体内过表达miR-126，可明显改善心肌细胞凋亡。这进一步支持我们的设想，即I/R早期在大鼠心肌缺血区，rniR-126表达降低可能与细胞凋亡有关。

综上所述，miR-126在急性心肌I/R损伤中的保护作用可能来自对缺血心肌细胞凋亡的抑制，并且效应具有剂量依赖性，miR-126的抗凋亡效应影响了Caspase-3的激活。其具体的分子机制有待进一步研究。

图1 正常与I/R大鼠心电图

图2 I/R大鼠心肌不同区域miR-126的表达的特征

图3 I/R大鼠心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3的表达特征

图4 转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126前后大鼠心肌miR-126的特征

图5 I/R大鼠转染rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126前后心肌凋亡调控相关因子BCL-2、BAX及CASPASE-3的表达特征

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The expression and effect of anti-apoptosis of microRNA-126 in rat myocardium during early phase of ischemia reperfusion

ZHENG Hua-feng，TAO Jing，ZHANG Bin，et al.Department of Cardiology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036，China

Objective To investigate the expression of microRNA-126 （miR-126）and its protective effects in rat myocardium during early phase of ischemia-reperfusion.Methods 48 SD rats were randomly divided into Sham group（control group），I/R 2 h group，I/R 4 h group，I/R 6 h group（n=12）.To compare the expression level of miR-126 and level of cell apoptosis between Sham group and the different I/R time point groups.rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126 was successfully constructed and 24 SD rats were divided into two groups randomly（n=12）：⑴I/R group：rats were treated with I/R after transfected with rAAV9-ZsGreen by coronary injection.⑵I/R+miR-126 group：rats were dealt with I/R after transfected with rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126 by coronary injection.To compare again the expression level of miR-126 and level of cell apoptosis in the two groups.Results MiR-126 was down-regulated in the ischemic area after I/R compared with the Sham group at 2 h，4 h and 6 h，but it was up-regulated in the non-ischemic area（P<0.05）.The level of CASPASE-3 and BAX was increased in the I/R group than the Sham group at 2 h，4 h and 6 h after I/R，but the level of BCL-2 was decreased when compared with the Sham group.After tranfected with rAAV9-ZsGreen-pre-miR-126，the level of CASPASE-3 and BAX were decreased in I/R+miR-126 group by comparing with the I/R group，while the level of BCL-2 was increased when compared with the I/R group.Conclusion The expression of miR-126 was downregulated and cell apoptosis was increased in ischemic area at the early phase of I/R.Over-expression of miR-126 can inhibit cell apoptosis and protect cardiac function.

MiR-126；I/R；Ischemic area；Apoptosis protein；Cell apoptosis

WU Chun，E-mail：wuchun2012@163.com

2015-07-16）

518036 广东省深圳市，北京大学深圳医院心内科

吴淳，E-mail：wuchun2012@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.11.020

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）11-1041-06