左西孟旦对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

刘永利 张基昌 潘洪涛 王旭渤 刘宁 史永峰 李杨雪 刘斌

基础研究

左西孟旦对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用

刘永利 张基昌 潘洪涛 王旭渤 刘宁 史永峰 李杨雪 刘斌

目的 研究左西孟旦对心肌细胞氧化应激损伤的保护作用。方法 ①MTT法检测不同浓度的左西孟旦及H2O2对大鼠心肌细胞生存率的影响。②光镜观察左西孟旦及H2O2对大鼠心肌细胞形态学的影响。③流式细胞仪检测左西孟旦及H2O2对大鼠心肌细胞凋亡的影响。结果 MTT显示：①浓度为0.03～0.24μmol/L的左西孟旦加入正常大鼠心肌细胞后，测得其吸光度值与空白对照组吸光度值接近，并没有促进增殖的作用；②当加入浓度＞0.3μmol/L的左西孟旦后，测得细胞吸光度值明显低于空白对照组；③H2O2500μmol/L和1000μmol/L处理大鼠心肌细胞，吸光度值明显低于空白对照组；④预先加入左西孟旦进行预处理的心肌细胞吸光度较单加入H2O2的吸光度值明显升高且与浓度呈正相关。光镜下观察：①单纯加入左西孟旦组的心机细胞呈现梭形，呈放射状或栅栏状排列，浓度增加，未见细胞伪足收缩及胞体变圆。②加入H2O2500μmol/L和1000μmol/L后，随H2O2浓度的增加，胞体变圆，伪足收缩的细胞增多。③有左西孟旦保护的心肌细胞，胞体变圆，伪足收缩的细胞数量与浓度在一定范围内呈正相关，左西孟旦浓度越高，胞体变圆，伪足收缩的细胞越少。流式细胞结果显示：①空白对照组早期凋亡为0.31%，晚期凋亡6.88%，坏死的心肌细胞4.65%，存活的心肌细胞88.16%。②H2O21000μmol/L组早期凋亡为1.52%，晚期凋亡8.03%，坏死的心肌细胞7.66%，存活的心肌细胞82.79%。③Levo 0.24μmol/L+H2O21000μmol/L组早期凋亡为0.44%，晚期凋亡6.48%，坏死的心肌细胞4.95%，存活的心肌细胞88.13%。结论 左西孟旦对大鼠心肌细胞氧化损伤有保护作用，且0.24μmol/L组作用较0.03μmol/L组作用更明显。

左西孟旦；心力衰竭；氧化应激；凋亡

心力衰竭是各种心血管疾病发展的最后阶段，随着对心血管疾病治疗方法研究的进展和人口寿命的延长，心力衰竭的发生率逐年增加。Framingham研究[1]表明，冠心病、高血压、糖尿病增高健康人群心血管疾病的发病率和死亡率[2]，是引起心衰的主要原因。心肌细胞的凋亡、氧化应激损伤是心力衰竭重要的病理生理基础。

作为治疗心力衰竭的新型药，左西孟旦（Levosimendan，Levo）兼有钙离子增敏（为主）、血管扩张及磷酸二酯酶抑制等作用，不是通过增加心肌细胞内钙离子浓度来增加心肌收缩力[3,4]，而是增加对钙离子的敏感性，进而增加心肌的收缩力。与传统的钙离子增敏剂的作用方式不同，其钙离子增敏作用是钙依赖性的，即在收缩期因细胞内钙浓度暂时升高而作用最强，舒张期的作用较弱，因此不会降低心脏的舒张功能，能很好地改善心功能[5]。与慢性心功能不全和急性充血性心力衰竭治疗所应用的传统正性肌力药相比，在减少心肌梗死面积、减少心律失常的发生率、增加心输出量、改善左心室功能等方面显示了明显的优越性[6]。

本实验从心肌细胞氧化应激入手，应用体外培养大鼠心肌细胞，以高浓度H2O2（500μmol/L和1000μmol/L）对培养的大鼠心肌细胞进行处理，模拟心肌细胞缺血、缺氧状态，观察左西孟旦抗氧化应激损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验选择和分组 左西孟旦每支12.5 mg/5 ml，相对分子质量为280.29 g/mol。我们将左西孟旦的药物浓度配制成 0.03、0.06、0.12、0.24，0.30、0.36、0.48、0.96、1.98 μmol/L 9组，加上空白对照组一共10组。

1.1.2 主要实验器材和试剂 流式细胞仪、振荡器、37℃5%CO2孵箱购自美国Thermo公司，胎牛血清、PBS、MTT、二甲亚风（DMSO）、H2O2、凋亡试剂盒购自北京化工厂，胰酶、不含EDTA的胰酶消化液购自上海试剂有限公司，左西孟旦（Levo）由齐鲁制药有限公司生产。

1.2 方法 将铺好的96孔板置于镜下观察，并放置于孵箱中，在37℃5%CO2孵箱中孵化12 h。

12 h后，取出96孔板，在光镜下观察细胞形态，细胞呈梭形生长，贴附于培养皿的底部，核为卵圆形，位于胞质的中央。

抽出96孔板内原有细胞培养液，加入上述9组不同浓度的药品，每个浓度重复6次。同时设置6个空白对照组，共10组，将96孔板再次放入37℃ 5%CO2孵箱中，孵24 h后再次在光镜下观察细胞形态。

将不同浓度的左西孟旦加入正常H9C2大鼠心肌细胞进行MTT检测，观察其对心肌细胞是否有促增值作用。

将不同浓度的左西孟旦加入H9C2大鼠心肌细胞培养液中进行预防处理15 min，同时设立空白对照组，应用实验中心已成熟的心肌细胞氧化应激损伤模型，对处理过的心肌细胞及未加入左西孟旦进行预处理的心肌细胞进行H2O2氧化应激处理，光镜下观察细胞的状态，并行MTT及流式细胞检测，观察左西孟旦对H2O2所致大鼠心肌细胞氧化损伤是否有保护作用。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0软件分析。计量资料以±s表示，偏态分别转化为正态分布后再进行分析，两组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度左西孟旦对大鼠心肌细胞存活率的影响 酶联免疫检测仪中，在570 nm波长处测定其吸光度（OD）值。每个样本6个重复孔，去掉一个最高值和一个最低值，用SPSS 20.0软件分析，结果见表1。

表1 不同浓度左西孟旦作用于大鼠心肌细胞后的吸光度（OD）值及标注差

不同浓度的左西孟旦（0.03～1.98μmol/L）作用大鼠心肌细胞24 h后，测得吸光度值，如图1所示：①浓度为0.03～0.24μmol/L的左西孟旦加入正常大鼠心肌细胞后，测得其吸光度值与空白对照组吸光度值接近，并没有促进增殖的作用；②当加入浓度＞0.3μmol/L的左西孟旦后，测得细胞吸光度值明显低于空白对照组（P＜0.05），表明当左西孟旦浓度＞0.3μmol/L时对细胞具有损伤作用，因此选取左西孟旦保护过氧化氢所致的心肌细胞损伤的浓度，要＜0.3 μmol/L。

2.2 左西孟旦对大鼠心肌细胞的影响 在光镜下观察：单纯加入左西孟旦组的心机细胞呈梭形，放射状或栅栏状排列，浓度增加，未见细胞伪足收缩及胞体变圆。避光条件下单独加入H2O2500μmol/L和1000μmol/L，2 h后观察细胞，随H2O2浓度的增加，胞体变圆，伪足收缩的细胞增多。在左西孟旦保护下加入H2O2，可见胞体变圆、伪足收缩的细胞逐渐减少，且与左西孟旦浓度呈正相关，左西孟旦浓度越高，胞体变圆、伪足收缩的细胞越少。见图2。

2.3 左西孟旦与H2O2共同作用对细胞存活率的影响 酶联免疫检测仪中，在570 nm波长处测定其吸光度（OD）值。每个样本6个重复孔，去掉一个最高值和一个最低值，用SPSS 20.0软件分析，结果见表2。

表2 不同浓度左西孟旦对抗不同浓度的H2O2所致大鼠心肌细胞氧化应激损伤后的吸光度（OD）值及标准差

加入左西孟旦组的心肌细胞与对照组相比，吸光度值未见统计学差异（P＞0.05），加入H2O2后测得H2O2500μmol/L和1000μmol/L组吸光度的值明显低于空白对照组，而预先加入左西孟旦进行预处理的心肌细胞的吸光度较单加入H2O2的吸光度值明显升高且与浓度呈正相关（P＜0.05）。见图3。

2.4 左西孟旦及H2O2对大鼠心肌细胞凋亡的影响 经流式细胞仪检测，如图4A所示，正常细胞组早期凋亡为0.31%，晚期凋亡6.88%，坏死的心肌细胞4.65%，存活的心肌细胞88.16%。单纯加入过氧化氢组与对照组相比，凋亡率明显增加，如图4B所示，早期凋亡为1.52%，晚期凋亡8.03%，坏死的心肌细胞7.66%，存活的心肌细胞82.79%。而用左西孟旦预处理心肌细胞后加入过氧化氢，与单纯加入过氧化氢组相比，细胞凋亡率明显降低，图4C所示，早期凋亡为0.44%，晚期凋亡6.48%，坏死的心肌细胞4.95%，存活的心肌细胞88.13%。

3 讨论

心衰的病理生理改变十分复杂，人们对其不断深入研究，20世纪40年代认为是体液潴留机制，60年代认为是泵功能障碍（血流动力学障碍）机制，而80年代认为后神经内分泌细胞因子系统的过度激活机制得到重视[7]。

对来自心力衰竭患者心肌标本的研究也证实，心肌凋亡指数（apoptosis index）高达 35.5%（发生凋亡的细胞核数/每100个细胞核），而对照仅为0.2%～0.4%[8]。氧化应激、心脏负荷增加、细胞因子、缺血缺氧、神经-内分泌失调等都可诱导心肌细胞凋亡。在心力衰竭发生、发展过程中，由于氧自由基生成过多和（或）抗氧化能力下降导致氧化应激的发生、DNA和线粒体的损伤及促凋亡信号激酶的激活，引起心肌细胞凋亡[9]。

心力衰竭药物治疗的基本原则是强心、利尿和扩血管。临床上常用具正性肌力作用的药物进行治疗，其中包括强心甙类、利尿剂、β受体阻断剂和部分激动剂、扩血管药和血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂（ACEI）等。近几年，钙增敏剂的研究与开发已成为一热门课题，为心衰的治疗提供了新的途径[10]，并取得良好的临床效果。

左西孟旦与心脏肌钙蛋白（心脏肌原纤维细丝）结合可以增强心脏肌钙蛋白C对钙离子的敏感性。本品还具有独特的双重作用模式，能增加心脏输出并使静脉、动脉和脑血管扩张，降低前负荷和后负荷，改善冠脉血流。

本实验从心肌细胞氧化应激入手，应用体外培养大鼠心肌细胞，能够代表心肌结构和功能的最基本单位，可以排除体内神经及液体因素的干扰，易于量化心肌细胞的改变，给予外源性H2O2作用于心肌细胞，类似于许多心血管疾病中在体心肌细胞所面临的H2O2爆发，以高浓度H2O2（500μmol/L和1000μmol/L）对培养的大鼠心肌细胞进行氧化损伤，以观察Levo抗氧化损伤的作用。

将左西孟旦分为0.03～1.98μmol/L共9组药物浓度，加入心肌细胞内，观察其对细胞的安全浓度。经MTT检测后，左西孟旦对正常大鼠心肌细胞无促增殖作用，与空白对照组相比，左西孟旦浓度＞0.3μmol/L组吸光度值明显降低（P＜0.05），表明当左西孟旦浓度＞0.3μmol/L的时候对细胞具有损伤作用，因此选取左西孟旦保护过氧化氢所致的心肌细胞损伤的浓度要＜0.3μmol/L。

光镜下显示，加入H2O2500、1000μmol/L，细胞形态有改变，胞体变圆，伪足收缩。当加入左西孟旦保护后再加入H2O2，可见胞体变圆、伪足收缩的细胞逐渐减少，且与左西孟旦浓度呈相关性，左西孟旦浓度越高，胞体变圆、伪足收缩的细胞越少。因此可初步认为左西孟旦有对抗H2O2所致氧化应激损伤的作用。

为进一步证实左西孟旦的抗氧化应激损伤，对光镜下观察到的细胞进行MTT检测。结果显示，加入左西孟旦组的心肌细胞与对照组相比，吸光度值无明显差异（P＞0.05），加入 H2O2后测得 H2O2500、1000μmol/L组吸光度的值明显低于空白对照组，而预先加入左西孟旦进行预处理的心肌细胞的吸光度较单加入H2O2的吸光度值明显升高且与浓度呈正相关（P＜0.05）。

流式细胞仪的结果进一步证实，单纯加入过氧化氢组与对照组相比，凋亡率明显增加，而用左西孟旦预处理心肌细胞后加入过氧化氢，与单纯加入过氧化氢组相比，细胞凋亡率明显降低，说明左西孟旦有对抗H2O2所致氧化应激损伤的作用。

当组织细胞缺血、缺氧时，氧自由基大量生成、堆积，预处理期mito KATP通道开放可激活蛋白激酶C，线粒体生成ROS而启动心肌保护作用，再灌注mito KATP通道开放又能抑制ROS的爆发，减少ROS对细胞的不可逆损伤，因此mito KATP通道开放既能增加ROS的生成也能减少ROS的爆发。有报道显示，左西孟旦抑制细胞凋亡的作用主要是与开放mito KATP有关[11]。心肌细胞和血管mito KATP通道开放，打开能源和宿神经体液调节，可逆转细胞内钙超载，增加细胞内的供血供氧，缓解心肌细胞凋亡、心肌重塑和心肌发炎[12,13]。

心肌缺血再灌注损伤的细胞死亡形式包括凋亡和坏死。活体和离体动物实验均显示，心肌缺血再灌注过程既可引起心肌细胞坏死，也可诱导心肌细胞凋亡。研究表明，凋亡细胞随缺血或再灌注时间延长而显著增多，提示心肌缺血或再灌注过程有促进或加速心肌细胞凋亡的作用[14]。线粒体内钙超载导致线粒体结构破坏和功能改变是诱发心肌细胞凋亡的一个关键因素[15]。近年来研究发现，心肌凋亡在缺血性心脏病、缺血再灌注损伤、心力衰竭等疾病过程中发挥十分重要的作用。

由于以上原因故可防止或减轻Ca2+增敏导致的舒张功能损害及细胞内钙超载，从而对缺血-再灌注细胞可起到良好的保护作用。同时左西孟旦开放mito KATP通道，使K+内流进入线粒体，降低了内膜电位差，使线粒体膜发生了去极化，降低了线粒体外Ca2+内流的驱动力，从而减轻线粒体钙超载，使细胞膜超级化，平滑肌舒张，从而扩张冠脉，增加心肌供血，对心肌产生保护作用[16]。左西孟旦对离体心脏Langendorff模型缺血-再灌注损伤保护作用已得到证实，左西孟旦作为抗心力衰竭药物在临床上已取得明显效果，但是否可将其应用于缺血性心脏病的治疗，仍需进一步的大规模临床试验去验证。

图1 MTT检测不同浓度左西孟旦作用于大鼠心肌细胞后的生存率比值

图2 光镜观察左西孟旦对大鼠心肌细胞的影响

图3 MTT检测不同浓度左西孟旦对抗不同浓度的H2O2所致大鼠心肌细胞氧化应激损伤后的生存率比值

图4 流式细胞仪检测左西孟旦及H2O2对大鼠心肌细胞凋亡的影响

［1］Ho KKL，PinskyJL，Kannel WB，et al.The epidemiology of heart failure：the Framingham study.J Am Coll Cardiol，1993，22：6A-13A.

［2］郑贵浪，廖保南，林千文.PM2.5通过线粒体介导的大鼠心肌细胞损伤作用机制的初步研究.中国心血管病研究，2014，12：936-938.

［3］Miyamac M，Camacho S，Weiner M，et al.AHemation of postischemic reperfusion injury is related to prevention of（Ca2＋）m overload in rat hearte.Am J Physiol，1996，271：H2145-2153.

［4］Yapici D，Altunkan Z，Ozeren M，et al.Effects of levosimendan on anyocaidial ischaemia-reperfusion injury.Eur J Anaesthesiol，2008，25：8-14.

［5］陈玥竹.慢性心衰的诊断、药物及非药物治疗进展.中国心血管病研究，2014，12：428-430.

［6］Yontar OC，Yalta K，Yilmaz MB.Superiority of levosimendan overdobutaminein rightventricle failure.CritCare Med，2010，38：342-344.

［7］陈良华，刘同宝.心力衰竭临床研究进展.山东医药，2005，45：67-69.

［8］ Uofgaard JP，Sigurdardottir KS，Treiman M.Protection by 6 aminoniconicotinanfide against oxidative stress in cardiac cells.Pharmacol Res，2006，54：303-310.

［9］冯慧远.心力衰竭的机制及临床诊治研究进展.中国医学装备，2010，7：47-49.

［10］赵恒利.左西孟旦药物代谢动力学基础研究.山东大学，2006：1-2.

［11］Maytin M，Colucci WS.Cardioprotection：a new paradigm in the management of acute heart failure syndromes.Am J Cardiol，2005，96：26G-31G.

［12］Louhelainen M，Vahtola E，Kaheinen P，et al.Effects of levosimendan on cardiacremodeling and cardiomyocyte apoptosis in hypertensive Dahl/Rapp rats.Br J Pharmacol，2007，150：851-861.

［13］Grossini E，Caimmi PP，Platini F，et al.Modulation of programmed forms of cell death by intracoronary levosimendan during regional myocardial ischemia in anesthetized pigs.Cardiovasc Drugs Ther，2010，24：5-15.

［14］赵明中，陈运贞，李嫒嫒.大鼠心肌缺血/再灌注损伤心肌细胞凋亡与Fas、FasL基因表达的变化.中华心血管病杂志，2001，29：605-608.

［15］Powers SK，Murlasits Z，Wu M，et al.Ischemia-reperfusioninduced cardiac injury：abrief review.Med Sci Spots Exerc，2007，39：1529-1536.

［16］Crestanello JA，Doliba NM，Babsky AM，et al.Opening of potassium channels protects mitochondrial function from calcium overload.J Surg Res，2000，94：116-123.

Protective effects of Levosimendan on oxidative damage in cardiomyocutes

LIU Yong-li＊，ZHANG Ji-chang，PAN Hong-tao，et al.＊Department of Cardiology， the Fourth Hospital of Jilin University，Changchun 130000，China

LIU Bin，E-mail：liubin3333@vip.sina.com

Objective To study whether there is protective effect of Levosimendan against oxidative damage in cardiomyocytes.Methods ⑴The different survival rates of rat cardiomyocytes corresponding different concentrations of Levosimendan were studied by MTT.⑵Observe rat cardiomyocytes morphology when treated by Levosimendan and H2O2with light microscope.⑶The rat cardiomyocytes apoptosis rate was examined by Flow cytometer technology when treated with Levosimendan and H2O2.Results Results of MTT：⑴Normal rat myocardial cells were treated by different concentrations of Levosimendan from 0.03-0.24μmol/L.The result of MTT showed that there is no significant difference between the treated group and normal control group.⑵When treated by Levosimendan which concentration was higher than 0.3μmol/L the optical density was much lower than that of normal controls.⑶The optical density fell obviously after treated by H2O2.⑷The optical density of the group which pretreated by Levosimendan did not fall as obviously as that was without pretreating.The optical density changedwith the concentration of Levosimendan.The cell morphology were observed by light microscope：⑴The rat cardiomyocytes which were treated by Levosimendan only showed fusiform cells，radial or fence-like arrangement.Morphology of rat cardiomyocytes did not change with different concentrations of Levosimendan.⑵The number of rounded cell bodies of the group treated by H2O2which concentration was 1000μmol/L were much more that was 500 μmol/L.⑶The Levosimendan could protect cardiomyocytes from H2O2，there were more rounded cell bodies than control group with higher concentration of Levosimendan，the higher the concentration of Levosimendan，the less shrinkage of cell pseudopods.Results of Flow cytometer：⑴The control group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 0.31%，6.88%，4.65%and 88.16%respectively.⑵The H2O21000 μmol/L group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 1.52%，8.03%，7.66%and 82.79%respectively.⑶The Levo 0.24μmol/L+H2O21000μmol/L group result is that the early apoptosis rate，late apoptosis rate，necrotic rate and the survival rate were 0.44%，6.48%，4.95%and 88.13%respectively.Conclusion Levosimendan has protective effects against oxidative damage in cardiomyocytes.The protective effect is much more obvious when the concentration of Levosimendan is 0.24μmol/L than that of 0.03μmol/L.

Levosimendan；Heart failure；Oxidative Stress；Apoptosis

吉林省直医学专项资助项目［项目编号：（2014）科技字（520）号］

130000 吉林省长春市，吉林大学第四医院心内科（刘永利、潘洪涛、王旭渤）；

吉林大学第二医院心内科（张基昌、刘宁、史永峰、李杨雪、刘斌）

刘斌，E-mail：liubin3333＠vip.sina.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.11.018

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2015）11-1033-05

2015-08-24）