Nrf2信号通路抑制剂对细粒棘球蚴作用的研究

王卓，姜玉峰，邢国强，吕海龙

Nrf2信号通路抑制剂对细粒棘球蚴作用的研究

王卓，姜玉峰，邢国强，吕海龙

目的研究Nrf2信号通路抑制剂DRB对体外培养的细粒棘球蚴原头节活力的影响。方法从自然感染细粒棘球蚴病的羊肝中获取新鲜细粒棘球蚴原头节，并于RPMI 1640培养基体外培养。实验分为DMSO空白对照组，25 g/L、50 g/L、75 g/L DRB处理组。通过伊红染色，在倒置显微镜下观察原头节活力和形态变化，并绘制生长活力曲线。在扫描电镜下观察原头节超微结构变化。结果对照组和25 g/L DRB处理组体外作用细粒棘球蚴原头节后，不同时间原头节活力比较，差异无统计学意义(F空白对照组=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB处理组=0.658，P＞0.05)。50 g/L DRB处理组和75 g/L DRB处理组体外作用细粒棘球蚴原头节后，不同时间原头节活力比较，差异均有统计学意义(F50g/LDRB处理组=6.686，P＜0.01;F75g/LDRB处理组=10.756，P＜0.01)。随着用药时间的延长和药物浓度的增加，DRB对原头节活力的抑制效果增强，且原头节超微结构发生改变。结论高浓度的Nrf2抑制剂对体外培养的细粒棘球蚴原头节有抑制作用，并且有一定的浓度和时间依赖性。Nrf2信号通路是抗氧化应激反应的关键因子，对细粒棘球蚴Nrf2信号通路进行研究，可能为治疗细粒棘球蚴病提供一个新思路。

细粒棘球绦虫;原头节;Nrf2信号通路;DRB;体外研究

王卓，姜玉峰，邢国强，等．Nrf2信号通路抑制剂对细粒棘球蚴作用的研究［J］．中国全科医学，2015，18 (29):3601－3605．［www.chinagp.net］

Wang Z，Jiang YF，Xing GQ，et al．Influence of Nrf2 signaling pathway inhibitor on echinococcus granulosus［J］．Chinese General Practice，2015，18(29):3601－3605．

棘球蚴病(echinococcosis)又称包虫病(hydatid disease)，发生在棘球蚴绦虫的中绦期幼虫，常寄生于人体器官及其他动物体内，从而造成对人体健康和畜牧业发展危害性极大的寄生虫病，且该寄生虫病是人和牲畜共同患有。据目前研究发现，棘球蚴绦虫存在许多种类。发生在我国多为细粒棘球蚴病，又称为囊型包虫病(cystic echinococcosis，CE)及多房棘球蚴病，又称为泡型包虫病(alveolar echinococcosis，AE)。这两种分型疾病分别由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus，E.g)和多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis，E.m)寄生在人体内部器官或者动物体内致病。我国新疆等地此病发病率高［1－4］。细粒棘球蚴可寄生在人体多个器官，但以肝脏最为常见(占50%～70%)，其次为肺脏(占20%～30%)，在脑、肾、脾等器官中亦可见到［5］。目前的肝细粒棘球蚴病治疗方案中，手术治疗是首选，并在术后予以药物辅助治疗。临床上手术采用的术式为“闭合式肝包虫外膜内外囊完整摘除术”［6］，这种手术方法的优点在于手术创伤小、术后并发症少和可根治性等，可降低肝细粒棘球蚴病的术后复发率。但是，手术过程中存在头节泄露以及切除不完全等问题，术后复发率也由此而升高。鉴于这种情况，术后的药物辅助治疗成为关键。近年来，许多学者在抗棘球蚴病药物方面做了大量研究，例如对吡喹酮、阿苯达唑、甲苯达唑等药物的作用进行了详细研究及临床效果观测。上述药物作为患者在术后使用的辅助治疗手段，其结果并不令人满意。更严重的是，有研究表明，患者在服用上述药物过程中，会产生严重的不良反应，甚至对生命造成危害［7－9］。

本研究在体外培养细粒棘球蚴原头节，将不同浓度的Nrf2抑制剂DRB体外作用于细粒棘球蚴原头节，观察原头节的变化情况。旨在为细粒棘球蚴病的药物治疗方法寻找一个新途径。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器主要试剂:DRB、二甲基亚砜(DMSO)、RPMI 1640培养基(Sigma公司)，小牛血清(Gibco公司)。仪器:37℃、5%CO2恒温培养箱(Nuaire公司)，CHK Olympus倒置显微镜(Olympus optical公司)，扫描电镜LEO1430VP(Olympus optical公司)。

1.2 方法

1.2.1 体外培养细粒棘球蚴原头节将自然感染细粒棘球蚴病的绵羊肝脏(新疆石河子市西部牧业有限公司提供)用75%乙醇溶液消毒表面，在超净台中，用注射器反复吸取羊肝表面的囊泡，把含原头节的囊液移入无菌瓶中。然后用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗原头节3次，沉淀充分后去除瓶内上层液体。清洗后的原头节用伊红染色法进行活力测试，染色标准为95%以上拒染。将原头节培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中，并加入双抗(青霉素和链霉素)，放于37℃、5% CO2恒温培养箱内培养。

1.2.2 Nrf2抑制剂DRB体外作用细粒棘球蚴原头节实验分为DMSO空白对照组，25 g/L、50 g/L、75 g/L DRB处理组。将在体外培养3 d后的细粒棘球蚴原头节用PBS清洗3次后，分别加入到上述培养基中，放置于37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2.3 倒置显微镜观察细粒棘球蚴原头节活力情况在培养基中培养时，每天均匀抽取150μl液体(平均含原头节90～120个)，抽取的原头节用伊红染色后，在倒置显微镜下观察其变化情况。存活的原头节因虫壁保护作用，不会被伊红染色作用为红色，相反，死亡的原头节或活力差的原头节因虫壁通透性增强，会被染为红色。由此，计算每天原头节活力。每3 d更换培养液，重复加药。实验重复3次。

1.2.4 扫描电镜观察细粒棘球蚴原头节超微结构将原头节用PBS反复清洗3次后，4%戊二醛将原头节固定24 h，再将原头节用50%乙醇溶液脱水5 min，70%乙醇溶液脱水10 min，80%乙醇溶液脱水30 min，90%乙醇溶液脱水1 h，最后用100%乙醇脱水过夜。脱水处理后的原头节进行真空喷金LOOA0，在扫描电镜下观察原头节超微结构变化情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料的比较采用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 倒置显微镜观察细粒棘球蚴原头节形态倒置显微镜下观察，空白对照组和25 g/L DRB处理组原头节散在分布，可见原头节活动，虫体结构饱满，呈椭圆形，内部丰富充实，结构清晰完整，钙颗粒清亮而明显(见图1A～D)。50 g/L DRB处理组作用第3天，原头节活动度较空白对照组减弱(见图1E)，第6天，原头节活动度较空白对照组明显减弱，原头节虫体变小(见图1F)。75 g/L DRB处理组作用第3天，出现虫体边缘不规整，空泡增多，钙颗粒明显减少(见图1G)，第6天，原头节虫体严重皱缩，顶突上的小钩排列紊乱，部分脱落，吸盘变型，内部结构消失(见图1H)。

图1 倒置显微镜观察经不同浓度DRB处理后的原头节形态Figure 1 Form of protoscoleces treated by different concentrations of DRB observed under inverted microscope

2.2 DRB对细粒棘球蚴原头节活力影响空白对照组和25 g/L DRB处理组体外作用细粒棘球蚴原头节后，不同时间原头节活力比较，差异无统计学意义(F空白对照组=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB处理组=0.658，P＞0.05)。50 g/LDRB处理组和75 g/LDRB处理组体外作用细粒棘球蚴原头节后，不同时间原头节活力比较，差异均有统计学意义(F50g/LDRB处理组=6.686，P＜0.01; F75g/LDRB处理组=10.756，P＜0.01，见图2)。

2.3 扫描电镜观察DRB对细粒棘球蚴原头节超微结构影响通过扫描电镜观察，空白对照组和25 g/L DRB处理组作用第6天，原头节体态饱满充实，呈椭圆形，并且形态结构完整，没有观察到原头节结构显著变化(见图3A、B)。50 g/L DRB处理组作用第3天，原头节虫体表层出现轻微褶皱，但大体形态并未改变(见图3C);作用第6天，原头节表层出现明显皱缩，虫体表面结构受到一定程度破坏，虫体形态发生改变(见图3D)。75 g/L DRB处理组作用第3天，原头节吸盘变型，头钩排列紊乱，虫体表层发生严重皱缩(见图3E);处理第6天，原头节虫体大部分凹陷，虫体结构严重破坏，甚至虫体溃解(见图3F)。

图2 DRB体外作用原头节活力曲线Figure 2 Vitality curves of protoscoleces influenced in vitro by DRB

图3 扫描电镜观察经不同浓度DRB处理原头节超微结构的变化Figure 3 Changes of ultrastructure of protoscoleces treated by different concentrations of DRB observed under SEM

3 讨论

Nrf2是存在于众多生物体内的核转录因子。Nrf2在1994年被研究人员发现，属于CNC亮氨酸拉链转录激活因子家族(cap'n'collar subfamily of basic leucinezipper)，该家族有6个成员，即Bach1、Bach2、Nrf1、NF－F2、Nrf2和Nrf3，并且广泛表达于人体组织中［10］。Nrf2能够直接影响抗氧化酶序列(antioxidant response element，ARE)的表达情况，从而在机体的氧化应激反应中发挥重要作用。在正常的生理状态下，细胞质中的Nrf2与Keap1(Kelch－like ECH－associated protein 1)大量结合并在胞质中快速降解，通过Keap1－Cullin E3连接酶，造成Nrf2/Keap1泛素化［11］。有学者研究发现，Caveolin－1(Cav－1)是Keap1所特有的Nrf2抑制剂，可帮助水泡运输，从而抑制人血红素氧合酶1(HO－1)和硫氧还蛋白还原酶Ⅰ这两种参与细胞氧化还原平衡的表达［12－13］。在细胞质和细胞核中，Cav－1可以与Nrf2不需要媒介而直接结合。同时研究发现，若Cav－1在肺上皮细胞中高水平表达，会导致Nrf2在细胞中的活性降低，从而使细胞内抗氧化酶的表达也相应下降［14］。

在Keap1调节的氧化剂或亲电化学传感过程中，由于MAPK信号通路中，例如JNK蛋白、ERK、P38等磷酸化后，Nrf2可以得到释放［15］，释放后的Nrf2逐渐转运并积累在拥有异质二聚体等转录因子(c－Jun、AP－1家族、M fa和c－Fos)的细胞核中［16］，辅助因子复合物特异性结合ARE序列，并广泛调控编码抗氧化酶基因，其中包括了谷胱甘肽－S转移酶(GST)、NADPH醌氧化还原酶－1(NQO－1)、血红素加氧酶－1(HO－1)、UDP－葡糖醛酸基转移酶等［17］。

研究表明，通过激活GSK－3激酶，使其进入细胞核，并发生一系列磷酸化反应，导致Nrf2由细胞核转运到细胞质中，并在泛素蛋白酶体系中降解。Nrf2信号通路也由此停止表达，以致影响抗氧化酶的一系列表达［18］。Rada等［19］提出了一种依赖Keap1的新型假说，在Nrf2的Neh6区域，由GSK－3对其产生丝氨酸残基磷酸化作用，把细胞核中的Nrf2释放出来，再和Trcp/ Cullin1 E3连接酶复合物进行泛素化结合。

Nrf2信号转导通路被认为是氧化应激调控的重要枢纽，并且现在又有一些新的证据表明，如表观遗传机制［20］和多态性［21］可参与调节Nrf2信号通路的转录活性。有研究说明转录抑制剂DRB作用于肿瘤细胞，可以使肿瘤细胞内Nrf2的表达降低，并且对肿瘤细胞造成损伤［22］。

目前，在各种感染性疾病中，越来越关注Nrf2信号通路。脓毒血症是由于寄主的免疫应答反应，解除了对细菌、真菌或病毒的管制，发生感染，导致多器官功能衰竭，甚至死亡。Nrf2－/－小鼠被证明较野生型小鼠对LPS诱导的脓毒性休克更敏感，暴露于相同LPS致死剂量情况下也有较高的死亡率［23］。此外，Nrf2信号通路在呼吸系统疾病的病理生理学方面也具有重要作用［24］。查加斯病是由克氏锥形虫感染引起，患者可能出现心脏、消化道系统炎症，并且由氧化应激反应导致细胞死亡。用Nrf2诱导剂包括钴原卟啉(CoPP)、萝卜硫素、紫檀芪或N－乙酰半胱氨酸作用小鼠后，表现出克氏锥形虫感染率下降［25］。疟疾是由疟原虫感染所引起的一种严重疾病。疾病的严重程度与过度炎性反应和不受控制的疟原虫增殖相关。相关研究报道，Nrf2诱导剂诱导感染恶性疟原虫的巨噬细胞，能够恢复其吞噬能力，这可能是一个治疗疟疾的新方法［26］。人类感染细粒棘球蚴病，由于原头节在体内器官中增殖，形成囊泡，可导致器官衰竭。在治疗方面手术是首选的治疗方式，但是在手术过程中难以避免原头节泄露，导致复发。术后服用药物，控制复发是辅助治疗的关键。现在临床用于治疗包虫病的药物主要为阿苯达唑和氟苯达唑等，这些药物不仅需要大剂量长时间给药，而且部分患者不能耐受药物产生的严重不良反应。有研究报道，20%的高渗氯化钠溶液在短时间内对原头节的杀伤力可达100%，但是若在术中用于病灶的局部灌洗，会引起严重不良反应，并会对周围正常肝组织造成一定程度的伤害［27］。

本研究探讨了Nrf2抑制剂对细粒棘球蚴原头节生长和形态结构的影响，实验结果表明，高浓度的Nrf2抑制剂DRB对体外培养的细粒棘球蚴原头节有抑制作用，并且有一定的浓度和时间依赖性。目前，细粒棘球蚴疾病的治疗仍是全球性的难题。Nrf2是调节氧化应激反应的重要元件，对其进行研究有助于从分子水平认识细粒棘球蚴的生长、发育、存活调控机制。

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Influence of Nr f2 Signaling Pathway Inhibitor on Echinococcus Granulosus

WANG Zhuo，JIANGYu－feng，XINGGuoqiang，et al．Department of Hepatobiliary Surgery，the First Affiliated Hospital of Shihezi University，Shihezi832003，China

Objective To investigate the in vitro effect of Nrf2 signaling pathway inhibitor DRB on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces．Methods We obtained fresh echinococcus granulosus protoscoleces from lamb liver naturally infected with echinococcosis granulose and conducted in vitro culture in RPMI1640medium．The sampleswere divided into four groups:DMSO control group，25 g/LDRB group，50 g/LDRB group and 75 g/LDRB group．By eosin staining，the activity and morphological changes of echinococcus granulosus protoscoleces were observed under inverted microscope，and activity curvesweremade．The ultrastructure of protoscoleceswas observed under scanning electronmicroscope．Results There were not significantly different in vitro effect of control group and 25 g/L DRB group on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces in different time(Fcontrol=0.542，P＞0.05;F25g/LDRB=0.658，P＞0.05)．There were significantly different in vitro effect of50 g/LDRB group and 75 g/LDRB group on the activity of echinococcus granulosus protoscoleces in different time (F50g/LDRB=6.686，P＜0.01;F75g/LDRB=10.756，P＜0.01)．With the lengthening ofmedication time and the increase of drug concentration，the inhibiting effect of DRB on protoscoleces vitality was strengthened，and the ultrastructure was changed．Conclusion High concentrations of DRB inhibitors can all inhibit in vitro cultured echinococcus granulosus protoscoleces，the dependence on concentration and time length exists．Nrf2 signaling pathway is a key factor for antioxidant stress．The study on the Nrf2 signaling pathway of echinococcus granulosusmay provide a new thought for the treatment of echinococcus granulosus．

Echinococcus granulosus;Protoccoleces;Nrf2 signaling pathway;DRB;In vitro

R 383.33

A

10.3969/j.issn.1007－9572.2015.29.023

2015－04－13;

2015－08－10)

(本文编辑:贾萌萌)

国家自然科学基金资助项目(81360410)

832003新疆石河子市，石河子大学第一附属医院肝胆外科(王卓，邢国强，吕海龙);石河子大学医学院组织胚胎学教研室(姜玉峰)

吕海龙，832003新疆石河子市，石河子大学第一附属医院肝胆外科;E－mail:lvhl1999@126.com