Aβ1～42及二氮嗪预处理对神经细胞Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达的影响

朱 瑾 夏春凤 李艳菊 马国诏 段瑞生 朱梅佳

(山东大学附属省立医院神经内科，山东 济南 250021)

过度氧化应激与自由基毒性作用在AD的发病中起着重要作用。Aβ产生大量的自由基，可直接氧化酶蛋白氨基酸残基，使酶失活，影响Na+-K+-ATP酶活性，引起神经细胞内Na+的聚集，K+的流失，细胞的离子失衡，内环境的紊乱。已有研究表明单唾液酸四已节苷脂(GM1)可以通过维持中枢神经细胞膜上的Na+-K+-ATP酶的活性〔1～4〕，起到维持细胞内外离子平衡、减轻神经细胞水肿、防止细胞内Ca2+聚集的作用;还可以对抗兴奋性氨基酸的神经毒性作用，减少自由基对神经细胞的损害，起到神经保护作用。而ATP敏感钾通道(ATP，KATP通道)开放药物二氮嗪可降低Aβ寡聚体聚集，用二氮嗪预处理能够抵抗Aβ1～42的神经毒性〔5〕。但二氮嗪的预处理是否影响Aβ对Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白的表达，目前尚未报道。因此，本研究旨在探讨Aβ1～42及二氮嗪预干预对神经细胞Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 Wistar种系的大乳鼠(出生24 h内)，雌雄不限，由山东大学实验动物中心提供;Aβ1～42、二氮嗪、多聚赖氨酸均购自美国Sigma公司;胎牛血清、B27 supplement及Neurobasal培养基均购自美国Gibco公司;DMEM高糖培养基购自海克隆公司;Na+-K+-ATP酶β亚基抗体购自美国Santa Cruz公司;DyLight 488，山羊抗鼠 IgG购自Abbkine公司;山羊抗鼠IgG/辣根酶标记购自中杉公司;二甲基亚砜(DMSO)购自上海生博医学生物工程科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠皮层海马神经细胞培养 选用Wsitar大鼠新生24 h的胎鼠，75%酒精消毒，在无菌条件下，用显微镊子分离出大脑皮层及海马置于D-Hank液中，剥除脑膜，然后将脑组织剪成碎块，0.125%胰酶(37℃)消化10 min，用含10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，吸管吹打均匀后200目不锈钢筛网过滤，1000 r/min离心10 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，吸管吹打成单细胞悬液，加到多聚赖氨酸包被的12孔板，接种密度6×105个/ml，培养皿的接种密度 2×106个/ml，37℃、5%CO2孵育箱中培养，第二天换含2%B27 supplement的Neurobasal的培养液，以后每2 d换液1次，第7天加药处理。

1.2.2 分组及药物处理 Aβ1～42人工重组蛋白质0.1 mg，溶于 10 μl DMSO 中，再用 100 μl磷酸盐缓冲液稀释(pH7.4)，配成浓度为221 μmol/L，即为原液。将原液置于37℃恒温箱内孵育48 h进行老化处理，4℃备用。二氮嗪(2 mg)溶于200 μl的DMSO中，终浓度为1 mmol/L，4℃备用。实验分为四组:空白对照组、单独 Aβ1～42干预组、二氮嗪预处理 1 h 后 Aβ1～42干预组、单纯二氮嗪预处理组，每组又分为24 h及72 h两个亚组。细胞培养第7天，二氮嗪预处理1 h后Aβ1～42干预组加入二氮嗪(50 μmol/L)预处理 1h 后加入 Aβ1～42(2 μmol/L)作用;单独Aβ1～42干预组加入等量的磷酸盐缓冲液预处理1 h后，加入等量Aβ1～42;单独二氮嗪预处理组为加入二氮嗪预处理1 h后加入等量培养液;对照组加等量磷酸盐缓冲液和培养液。分别在孵育24、72 h后进行免疫荧光及免疫印迹检测。

1.2.3 免疫荧光检测各组Na+-K+-ATP酶β亚基的蛋白表达培养加药后的细胞爬片，用4%的多聚甲醛固定15 min，0.2%Triton孵育30 min，用封闭液室温封闭60 min，去封闭液后加入稀释的鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亚基抗体一抗(1∶50)4℃过夜，次日磷酸盐缓冲液(PBST)洗3×5 min，加二抗室温60 min，PBST 洗3×5 min，二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核后防荧光淬灭封片剂封片，用PBS代替一抗作为阴性对照，荧光显微镜观察染色结果。

1.2.4 Western印迹检测各组Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白的表达 Aβ1～42作用神经细胞24 h及72 h后提取细胞并用PBS洗涤3次后晾干，加入适量的蛋白裂能液(RIPA)裂解液苯甲基磺酰氟溶液(PMSF)(100∶1)冰浴中裂解细胞，刮勺收集细胞，4℃离心后，一组进行蛋白浓度测定，用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量，另一组加1/3的loading buffer(4×)，100℃水浴10 min，－80℃冻存。次日灌胶，取相应蛋白量上样，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入一抗稀释液，鼠抗大鼠Na+-K+-ATP酶β亚基抗体一抗(1∶100)于4℃孵育过夜，次日用TBST缓冲液洗3×10 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体)于室温孵育1 h，再用TBST缓冲液洗3×10 min，加入发光剂(ECL)显色，以β-actin作为内参，用图像分析软件Band Scan进行光密度积分值分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0软件行单因素方差。

2 结果

2.1 免疫荧光检测24 h、72 h、神经细胞Na+-K+-ATP酶β亚基荧光强度 单独Aβ1～42作用神经细胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亚基荧光染色强度较对照组没有明显改变;经二氮嗪预处理后Aβ1～42作用24 h后，Na+-K+-ATP酶β亚基的荧光染色强度也没有明显改变。单独Aβ1～42作用神经细胞72 h后，Na+-K+-ATP酶β亚基荧光染色强度较对照组显著降低;经二氮嗪预处理后Aβ1～42作用72 h后，与单独Aβ1～42干预组相比较有所增强;单独二氮嗪干预组Na+-K+-ATP酶β亚基荧光染色强度与对照组和Aβ1～42+二氮嗪组没有明显改变。见图1。

图1 免疫荧光染色观察各组细胞培养24 h、72 h后Na+-K+-ATP酶β亚基荧光强度变化(×400)

2.2 蛋白电泳检测24 h、72 h神经细胞Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达变化 单独Aβ1～42作用神经细胞24 h后，Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达与对照组比较没有明显改变;二氮嗪预处理神经细胞1 h协同Aβ1～42作用24 h后及单独二氮嗪组Na+-K+-ATP酶β亚基的蛋白表达明显低于对照组及单独Aβ1～42组(P＜0.01)。单独Aβ1～42作用72 h后，Na+-K+-ATP酶 β 亚基蛋白表达较对照组降低(P＜0.05);二氮嗪预处理1 h协同Aβ1～42共同作用72 h后，与单独Aβ1～42干预组相比，增加了Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达量(P＜0.05);单独二氮嗪干预组Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达明显低于以上各组(P＜0.01)。见图2。

图2 免疫印迹检测各组处理24 h、72 h Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达的变化

3 讨论

老年炎性斑内的大量Aβ沉积在AD发病机制中起到重要作用。而Aβ的神经毒性机制也极其复杂，与过度氧化应激、Ca2+的超载、谷氨酸浓度的增高等有着一定的关系。

本研究提示Aβ对Na+-K+-ATP酶β亚基有影响，其机制可能与启动细胞的氧化应激反应、神经细胞的凋亡级联反应有关〔6〕。Aβ本身或通过多种途径可以产生、诱导活性氧(ROS)，使神经细胞质中自由基浓度升高，它的增加使脂质过氧化，形成脂质过氧化物，蛋白被氧化修饰，线粒体功能失调〔7〕，使有氧呼吸链电子传递形成短路，减少ATP生成;还可经自由基链式反应的作用，使细胞膜受到损害〔8〕，继而影响ATP酶，使其活性下降。谷胱甘肽(GSH)在抗氧化物及自由基的损伤中有重要作用，是大脑的主要抗氧化剂，氧自由基攻击Na+-K+-ATP酶中富含的赖氨酸、脯氨酸、半胱氨酸等，减少GSH的合成，加重氧化应激〔9〕;还能导致细胞内 Na+、Ca2+增加，K+降低，影响跨膜Na+浓度梯度的重建，进一步影响Na+-Ca2+交换，加重Ca2+浓度的升高。Aβ还会直接导致细胞内Ca2+的升高〔10〕，Ca2+超载也会引起细胞内环境失衡，从而导致离子通道开放，谷氨酸大量释放到突触间隙或直接影响谷氨酸转运体(GLT)-1和谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)的活性功能，从而导致突触间隙谷氨酸浓度的异常增高及线粒体功能失调〔11〕，刺激N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体过度兴奋〔12〕，细胞代谢紊乱。

二氮嗪在有神经细胞毒性物质Aβ1～42长时间如72 h存在时，首先Aβ1～42启动了细胞线粒体介导的过度氧化应激反应和细胞凋亡级联反应，二氮嗪预开放线粒体ATP敏感钾离子通道，它的开放对维持线粒体膜电位的极化状态有极其重要的作用。K+主要自细胞质流向线粒体内，离子的跨膜转运形成线粒体膜电位的升高〔13〕，细胞膜超极化或复极化，抑制电压依赖性钙通道的开放，减少Ca2+通过L型通道内流，以及Na+-Ca2+交换的逆转〔14〕，有益于减少细胞线粒体内钙超载，增强细胞在代谢应激条件下的活性。线粒体膜电位升高在一定程度上可以减少细胞内氧自由基的生成，减少了氧化应激反应，产生自身保护作用，保护了神经细胞活性，维持了细胞的ATP正常代谢，促进了细胞膜上Na+-K+-ATP酶的生理功能，增强向细胞内转运K+的功能，从而增加了Na+-K+-ATP酶β亚基蛋白表达水平;还使线粒体基质体积增加，能够激活脂肪酸氧化及电子转移，促进ATP的生成，有利于神经细胞的存活〔15〕。

但是，二氮嗪在有神经细胞毒性物质Aβ1～42较短时间如24 h存在时，一方面，有研究表明，当胞内ATP水平低到某一临界值时，KATP通道被激活发挥作用〔16〕。另一方面，Aβ1～42作用导致细胞线粒体介导的氧化应激反应，同时还没有启动细胞凋亡级联反应。因此，即使当二氮嗪预开放 KATP通道，钾离子主要自细胞质流向组织间液，还没有流向线粒体内。可能24 h细胞的氧化应激反应主要发生在细胞间质，而不是线粒体内。因此，Aβ1～42和二氮嗪共同作用24 h，并没有明显地影响到 Na+-K+-ATP酶β亚基的生理作用，可能是二氮嗪与Aβ1～42共同作用对Na+-K+-ATP酶β亚基的影响呈现时间依赖性。

另有研究证实二氮嗪作用神经细胞可导致ROS的产生，在健康细胞中此作用可能不明显〔17〕，当单独二氮嗪作用神经细胞时，产生氧化应激反应，影响Na+-K+-ATP酶活性。另外，二氮嗪是KATP通道开放剂，开放了KATP通道后，可促进神经细胞胞膜超极化，线粒体内膜去极化，K+主要由细胞质外流到组织间液，从而在一定程度上抑制了Na+-K+-ATP酶将2个K+泵入细胞内的生理作用。因此，24 h和72 h蛋白电泳显示单独应用二氮嗪明显降低了Na+-K+-ATP酶β亚基的蛋白表达水平。

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