切口平移法制备DNA探针的原理

张大海

摘 要 DNA探针可用于DNA分子的定量分析、特异识别，对分子生物学、基因组学、病毒学等相关学科的发展具有十分重要的意义，切口平移法是制备DNA探针的常见方法。介绍了该方法的关键酶和DNA探针的原理。

关键词 切口平移法 DNA探针

中图分类号 Q-49 文献标志码 E

2015年的江苏高考生物试题的33题涉及切口平移法制备DNA探针，但这一知识点高中生物教材中没有提及。题干中的描述也较为简单，虽然题中配有相关图示，但学生仍很难理解。下面以大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ为例，说明切口平移法制备DNA探针的原理，以解释学生的疑问。

1 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ功能的复杂性

DNA聚合酶Ⅰ是Kornberg从大肠杆菌中分离出第一种DNA聚合酶，该酶相对分子质量为103 000，由一条单一的多肽链组成，据测定，每个大肠杆菌细胞中约有400个DNA聚合酶Ⅰ的分子。

当有底物和模板存在时，DNA聚合酶Ⅰ可催化脱氧核苷酸逐个加到具有3′-OH末端的多核苷酸链上。与其他种类的DNA聚合酶一样，DNA聚合酶Ⅰ只能在已有的核酸链上延伸DNA链。

值得注意的是DNA聚合酶Ⅰ是一种多功能酶，可以催化以下的反应：

① 通过核苷酸聚合反应，使DNA链沿5′→3′方向延长，即具有DNA聚合酶活性；

② 由3′端水解DNA链，即具有3′→5′核酸外切活性；

③ 由5′端水解DNA链，即具有5′→3′核酸外切活性。

因此，DNA聚合酶Ⅰ实际上兼有聚合酶、3′→5′核酸外切酶和5′→3′核酸外切酶活性。

若用蛋白酶对DNA聚合酶Ⅰ进行有限水解，可以得到相对分子质量为68 000和35 000的2个片段，其中68 000片段称为Klenow片段。聚合酶活性区域和3′→5′核酸外切酶活性区域相邻，位于其中（图1）。DNA链沿5′→3′方向延长和3′→5′核酸外切几乎是完全相反的反应过程，催化这两个过程的活性区域紧密相邻，表明两者之间有着重要的内在联系。

X射线衍射研究揭示，Klenow片段的空间结构中有2个明显的裂隙，其中一个裂隙为双链DNA的结合位点；另一裂隙为聚合反应的催化位点以及单链模板的结构位点。3′→5′核酸外切酶位点十分靠近聚合酶位点，合成链的3′端可在其间摆动（图2）。

当模板DNA落入DNA聚合酶Ⅰ的拇指结构和指形结构间的凹槽时，引起构象改变，从而使聚合酶能够握住DNA分子。由于凹槽空间只允许底物与模板之间按碱基互补原则配对，非配对的碱基因凹槽空间不适合而不能进行聚合反应，因此，酶对底物进行了一次配对专一性的核对。这一机制保证了新合成的链严格按模板链的互补碱基顺序进行聚合。

虽然如此，错配的碱基仍然会不可避免的出现，DNA聚合酶Ⅰ的3′→5′核酸外切酶活性能够切除单链DNA的3′末端核苷酸，而对双链DNA则不起作用。因而，不能形成碱基对的错配核苷酸可被该酶水解下来。也就是说，在正常配对的情况下，3′→5′外切酶活性不能作用于生长链；但一旦发生错配碱基，聚合反应立即停止，生长链的3′末端核苷酸，落入3′→5′外切酶位点，错配的核苷酸即被除去，然后聚合反应才能继续进行。因此，3′→5′核酸外切酶活性可以被认为是聚合过程中的第二次核对。因此，DNA复制过程中，碱基配对就经过双重核对，即聚合酶的选择作用和3′→5′核酸外切酶的校对作用。实验表明，在无3′→5′核酸外切酶校对功能时，DNA聚合酶Ⅰ掺入核苷酸的错误率为10-5，具有校对功能后错误率下降至5×10-7。

与此同时，DNA聚合酶Ⅰ还具有5′→3′核酸外切活性，只作用于双链DNA的碱基配对部分，从5′末端水解下核苷酸或寡核苷酸。这一功能具有以下重要意义：DNA分子在紫外线照射时容易形成嘧啶二聚体，5′→3′核酸外切活性可切除嘧啶二聚体，以减少基本突变的概率；同时DNA半不连续合成中冈崎片段5′端RNA引物的切除，也有赖于这种外切活性。

2 切口平移法制备DNA探针的过程

DNA探针是利用同位素、生物素或荧光染料等标记的特定DNA片段，可用于DNA分子的定量分析、特异识别，对分子生物学、基因组学、病毒学等相关学科的发展，具有十分重要的意义。根据是否使用放射性标记物，DNA探针可分为放射性标记探针和非放射性标记探针，江苏高考试题中所涉及的荧光探针即属于非放射性标记探针，较之传统的放射性标记探针，有检测快速、重复性好、用量少、无辐射等优势，近年来有逐渐取代放射性标记探针的趋势。

使用切口平移法制备DNA探针的过程可大致分成以下几个步骤：

① 使用DNA酶Ⅰ在DNA双链上随机切开若干切口，切口处分别形成3′和5′末端（图3）。

② 利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′核酸外切活性，在切口处按5′→3′方向切除单核苷酸；同时利用DNA聚合酶Ⅰ的5′→3′的聚合酶活性，在切口处3′端加入底物中的单核苷酸，使脱氧核苷酸链得以延伸（图4）。

③ 随着反应的进行，切口不断按5′→3′的方向移动，底物中被标记的单核苷酸被掺入到DNA链中，直至被标记的DNA片段两条链的3′端时完成标记（图5）。

3 切口平移法制备DNA探针的释疑

3.1 DNA酶Ⅰ不像限制性内切酶那样将DNA切断的原因

限制性内切酶作用于DNA分子时，能识别DNA分子中的限制性片段，并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，最终将DNA分子切断。而DNA酶Ⅰ同样是切断磷酸二酯键，但只是在DNA分子上留下切口而未将DNA分子切断，其原因在于，限制酶的识别序列很短（大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成，也有少数的限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸组成）。以EcoRⅠ为例，其识别序列为GAATTC，当其在识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生黏性末端，虽然在其中仍然存在氢键作用和碱基堆积力，但由于两条链的切割位点之间只有4个碱基对，其作用不足以维持DNA分子的稳定，因而被切断。但是DNA酶Ⅰ作用于DNA分子时是随机切开DNA分子中的磷酸二酯键，DNA两条链上的切口的距离较远，其间的碱基对间的氢键和碱基堆积力，足以维持DNA分子的稳定，因而不会被切断，而只是留下切口。

3.2 DNA酶Ⅰ作用后留下的多个切口是否会影响标记

DNA酶Ⅰ可以使DNA分子的两条链上随机出现多个切口，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，每个切口外均进行3′末端的聚合反应和5′末端的外切反应，相互之间无干扰，但每条链上最接近5′末端的切口上结合的DNA聚合酶Ⅰ，会将其他的聚合酶所形成的区域中的核苷酸逐一切除，并形成一条完整的脱氧核苷酸链，从而完成整个的标志过程。

参考文献：

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[2] 郭仁，张和君，董德祥.分子细胞生物学[M].北京：北京医科大学中国协和医科大学出版社，1993：213-214.