响应面对里氏木霉产纤维素酶液体发酵条件的优化

王强强　莫海飞　杨玉玲等

摘要：采用单因素试验和响应面法对里氏木霉（Trichoderma reesei） RutC-30产纤维素酶的液体发酵条件进行优化并以滤纸酶活力（FPA）作为响应值。结果表明，最优发酵条件为玉米芯粉3.42%，牛肉膏添加量1.70%，吐温-80添加量0.08%，初始pH 5.04，此条件下发酵液中的滤纸酶活力为12.10 U/mL，较未优化条件下得到的最高酶活力7.03 U/mL提高了72.12%。

关键词：里氏木霉（Trichoderma reesei）；玉米芯粉；纤维素酶；酶活；液体发酵；响应面

中图分类号：TQ925 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）15-3735-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.15.040

Abstract： Single-factor tests and response surface methodology， with filter paper activity （FPA） as response value， were used to optimize the liquid-state fermentation medium for cellulase production by Trichoderma reesei RutC-30.The results showed that the optimum medium was composed of corncob powder 3.42%，beef extract 1.70%，and Tween-80 0.08% with initial pH 5.04. Under this condition，the FPA reached to 12.10 U/mL and increased by 72.12%，compared with the maximum FPA （7.03 U/mL） before optimization.

Key words：Trichoderma reesei；corncob powder；cellulase；enzyme activity；liquid-state fermentation；response surface methodology

植物纤维素类资源被统称为生物质资源，主要包括农林、固体及能源作物废弃物，其中农林废弃物（如麦秆、麸皮、玉米秸秆、玉米芯、甘蔗渣、森林采伐加工剩余物等）中含有最丰富的纤维素类可再生资源[1-4]。中国是玉米种植第二大国，且在粮食作物总产量中占有很大比例[5-7]。玉米芯中含有丰富的营养成分，但因其适口性和营养性差，在饲料行业中未能得到有效的利用，随着科技不断更新，玉米芯诸多潜在功能与价值逐渐被开发出来[8]。玉米芯资源价格低廉，其综合利用可以缓解因燃烧而引起的环境污染问题，具有不可估量的生态效益、经济效益与社会效益[8-11]。本试验利用纤维素酶工业高产丝状真菌里氏木霉（Trichoderma reesei）[12]，采用液体发酵的方式，以玉米芯粉为发酵底物对产纤维素酶条件进行优化，以期为玉米芯粉更好地产纤维素酶利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 里氏木霉RutC-30，由中国科学院微生物研究所提供。

1.1.2 主要仪器与设备 GSKP-01BII型隔水式电热恒温培养箱，湖北省黄石市医疗器械厂；MaxQ摇床、ST16R台式高速冷冻离心机，美国Thermo Scientific公司；HH-6数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；UV-6100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Delta-320型pH计，瑞士Mettler-Toledo有限公司。

1.1.3 主要材料与试剂 玉米芯粉：取玉米田地中自然风干的玉米芯铡成小块烘干，用粉碎机粉碎后过筛（1.0 mm）；吐温-80：分析纯，成都康迪生物技术有限公司；0.05 mol/L、pH 4.8柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，DNS试剂。

1.1.4 培养基 PDA斜面；MM培养基：葡萄糖20 g，硫酸铵5.0 g，KH2PO4 15 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，CaCl2 0.45 g，CoCl2·6H20 3.7 mg，FeSO4·7H2O 5 mg，ZnSO4·7H2O 1.4 mg，MnSO4·H2O 1.6 mg，加去离子水至1 000 mL，pH自然；基础产酶培养基：将MM培养基中葡萄糖等量换成微晶纤维素即可。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化与扩大培养 将冷藏菌接种在新鲜PDA平板上，30 ℃活化培养，待产孢后，取1 mL 1×107个/mL的孢子悬液接入装有50 mL MM培养基中，180 r/min、30 ℃恒温培养72 h，待产菌丝。

1.2.2 产酶培养及粗酶液提取 2层纱布过滤菌丝并称取1 g（湿重）菌丝，接种到50 mL基础产酶发酵培养基中，180 r/min、30 ℃振荡培养5 d。发酵液于4 ℃、8 000 r/min离心10 min，上清即为粗酶液。

1.2.3 酶活力测定 滤纸酶活力（Filter Paper Activity，FPA）测定[13]：将新华滤纸裁成6 cm×1 cm的长方形，卷成圆筒状置于试管底部，加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1.8 mL，50 ℃预热5 min，再加入稀释酶液0.2 mL（空白对照加等体积灭活酶液），50 ℃水浴保温60 min后，迅速冷却。加入3 mL DNS试剂，沸水浴10 min后迅速冷却，补加去离子水至25 mL，摇匀静置，于540 nm处测定吸光值。

酶活定义：在试验条件下，1 mL酶液1 min水解底物生成1 μg还原糖（以葡萄糖计）所需酶量为一个酶活力单位（U/mL）。endprint

1.2.4 产酶条件优化 ①单因素试验。保持其他因素不变，考察碳源（玉米芯粉、麸皮、微晶纤维素、乳糖、甘油、葡萄糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、硫酸铵、尿素、硝酸钠）、吐温-80添加量、产酶初始pH以及氮源与碳源添加量对里氏木霉RutC-30发酵产纤维素酶活力的影响。②响应面优化试验。在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken设计4因素3水平试验，响应面分析优化里氏木霉RutC-30产纤维素酶发酵条件，并进行最优验证试验。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 最优碳源及其最适添加量 在基础产酶培养基中分别添加2.0%的不同碳源并测定其FPA，结果（图1）表明，玉米芯粉、麸皮对里氏木霉RutC-30产纤维素酶都有明显的诱导效果，其中玉米芯粉效果最佳。因此选取玉米芯粉为碳源，考察玉米芯粉不同添加量（m/V，g：mL，下同）对里氏木霉RutC-30产纤维素酶的影响，结果见图2。由图2可知，当玉米芯粉添加量为3.5%时，发酵液中的FPA最高。

2.1.2 最优氮源及其最适添加量 向基础产酶培养基中分别添加0.5%的氮源，测定发酵液中纤维素酶活力。结果（图3）表明，有机氮源较无机氮源对里氏木霉RutC-30产纤维素酶有更好的效果，其中牛肉膏对产酶效果最佳。在基础培养基中依次加入不同量牛肉膏，确定牛肉膏的最适添加量（m/V，g：mL，下同），结果见图4。由图4可知，当牛肉膏添加量为2.0%时，发酵液中FPA最高。

2.1.3 最优吐温-80添加量 在基础产酶培养基中加入不同质量的吐温-80，测定其对里氏木霉RutC-30产纤维素酶的影响，结果如图5所示。由图5可知，当吐温-80添加量（m/V，g：mL，下同）较少时，发酵液中纤维素酶活力逐渐增高，当添加量为0.12%时，发酵液中的FPA最高，较未添加条件下酶活力提高了48.46%，继续增加吐温-80酶活力反而下降。

2.1.4 最优产酶初始pH 设定其他因素不变，调节基础产酶培养基初始pH并检测不同pH条件下发酵液中纤维素酶活力，结果见图6。由图6可知，当基础产酶培养基的初始pH为5.0时，发酵液中纤维素酶活力最高。

2.2 响应面优化结果

2.2.1 Box-Behnken试验设计与结果 在单因素试验基础上，应用Box-Behnken设计4因素3水平试验，因素与水平见表1，结果见表2。

2.2.2 数学模型建立及显著性检验分析 根据Design Expert 8.0.5b软件对表2中试验结果进行二次线性回归方程拟合，得到数学模型：Y=14.51-1.53A-2.61B-0.40C+0.58D-3.31AB+3.12AC-0.68AD+1.30BC+2.04BD-1.55CD-4.38A2-1.51B2-1.05C2-1.38D2。

由表3可知，模型显著（P<0.05）， 因变量与自变量间线性关系较好（R2=0.789 1），模型调整复相关系数R2Adj=0.543 0，失拟项P=0.928 7>0.05，说明模型拟合程度较好且失拟不显著，预测值与实际值间具有高度的相关性。由响应面分析F可知，各因素对里氏木霉RutC-30发酵产纤维素酶活力影响的主次顺序为牛肉膏、玉米芯粉、初始pH、吐温-80。

2.2.3 培养基的响应面优化与分析 利用Design Expert 8.0.5b软件对数据进行分析得到响应面及等高线图，各因素间交互作用对响应值的影响可直观地反映出来。其中等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素间的交互作用显著，相反，圆形则表示不显著[14，15]。具体响应面优化分析见图7-图12。由图7可知，设定吐温-80添加量及初始pH均为最优水平。当玉米芯粉加入量为某一值时，牛肉膏添加量为1.70%时FPA最高；当牛肉膏添加量为某一值时，随着玉米芯粉添加量的逐渐增加，FPA呈现先增高后降低的趋势。由等高线图可知，两因素交互作用明显且达到显著水平（P=0.032 6）。再由等高线变化密集度可知，玉米芯粉添加量对FPA的影响强于牛肉膏添加量。

由图8可知，设定牛肉膏添加量及初始pH均为最优水平。当玉米芯粉加入量为某一值时，随着吐温-80添加量的逐渐增加，FPA逐渐增高，当其添加量为0.08%时，FPA最高；当吐温-80添加量一定时，FPA随着玉米芯粉添加量的逐渐增加而出现先增高后降低的趋势。由等高线图可知，玉米芯粉添加量与吐温添加量交互作用明显且达到显著水平（P=0.041 8）。再由等高线变化密集度可知，玉米芯粉添加量对FPA的影响强于吐温-80。

由图9可知，设定牛肉膏添加量及吐温-80添加量均为最优水平。当玉米芯粉添加量为某一值时，随着初始pH的逐渐增加，FPA呈现先增高后降低的趋势；当初始pH为某一值时，随着玉米芯粉添加量的逐渐增加，FPA也出现先增高后降低的趋势。由等高线图中等高线形似圆形，表明玉米芯粉添加量与初始pH交互作用明显但未达到显著水平（P=0.631 3）。由等高线图等高线变化密集度可知，玉米芯粉添加量对FPA的影响强于初始pH。

由图10可知，设定玉米芯粉添加量及初始pH均为最优水平。当牛肉膏添加量为某一值时，吐温-80添加量为0.08%时，FPA最高；当吐温-80添加量为某一值时，随着牛肉膏添加量的逐渐增加，FPA逐渐降低，加入1.70%牛肉膏时，FPA最高。由等高线图可知，牛肉膏添加量与吐温-80添加量交互作用明显但未达到显著水平（P=0.352 0）。由等高线图等高线变化密集度可知，牛肉膏添加量对FPA的影响强于吐温-80添加量。

由图11可知，设定玉米芯粉添加量及吐温-80添加量均为最优水平。当牛肉膏添加量为某一值时，随着初始pH的逐渐增加，FPA呈现先增高后降低的趋势；当初始pH为某一值时，随着牛肉膏添加量的逐渐增加，FPA逐渐降低，牛肉膏添加量为1.70%时，FPA最高。由等高线图可知，牛肉膏添加量与吐温-80添加量交互作用明显但未达到显著水平（P=0.162 5）。由等高线图等高线变化密集度可知，牛肉膏添加量对FPA的影响强于初始pH。endprint

由图12可知，设定玉米芯粉添加量及牛肉膏添加量均为最优水平。当吐温-80添加量为某一值时，FPA随着初始pH的逐渐增加而呈现先增高后降低的趋势；当初始pH为某一值时，吐温-80添加量为0.08%时，FPA最高。由等高线图可知，吐温-80添加量与初始pH交互作用明显但未达到显著水平（P=0.281 0）。由等高线图等高线变化密集度可知，初始pH对FPA的影响强于吐温-80添加量。

2.2.4 最优发酵条件验证结果 由Design Expert 8.0.5b软件分析可知最优发酵条件为玉米芯粉3.42%、牛肉膏添加量1.70%、吐温-80添加量0.08%、pH 5.04时，预测FPA最高为16.40 U/mL。为了检验模型预测的准确性，依据响应面试验优化得到的培养基组成进行验证试验，得到FPA为12.10 U/mL，较未优化的条件得到的最高酶活力7.03 U/mL提高了72.12%，与模型预测值符合度为73.78%。

3 结论

相比于固体发酵，液体发酵更适合于工业的大规模生产[11]。本试验中利用农田地里自然风干的玉米芯，经过粉碎制得玉米芯粉后直接用于试验研究，并得到了较好的试验效果，减少了因对玉米芯前处理而带来的资源及成本的浪费[12]。

吐温-80是一种良好的细胞表面活性剂，因能改变细胞膜的通透性而有效促进胞内蛋白的释放[16]。刘佳等[17]添加临界胶束浓度的吐温-80后使酶活提高了31.8%；王亚林等[18]使用土温-80后FPA提高了29.6%；本试验中添加0.12%吐温-80时酶活力提高了48.46%。可见吐温-80对里氏木霉RutC-30液体发酵产纤维素酶有较好的促进作用。

响应面法（Response surface analysis，RSA）是数学方法和统计方法结合的产物[19]，具有减少试验次数，缩短试验周期，回归方程精度高，并能直观反映因素间的交互作用等特点；可同时对影响试验的多因素间的交互作用进行优化与评估，精确反馈因素与响应值间的关系，并得到最佳的发酵条件。RSA是目前微生物发酵条件优化常用的方法。冯培勇等[20]经响应面条件优化酶活力提高了34.4%。本试验中较未优化条件下FPA提高了72.12%。

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