Matrigel三维培养下卵巢癌细胞生长状况观察

蔡国徽，韩云竹，唐富山，宋鸿（遵义医学院微生物学教研室，贵州 遵义 563099）

CAI Guo-hui，HAN Yun-zhu，TANG Fu-shan，SONG Hong（Department of Microbiology，Zunyi Medical College，Zunyi Guizhou 563099，China）

Matrigel三维培养下卵巢癌细胞生长状况观察

蔡国徽，韩云竹，唐富山，宋鸿
（遵义医学院微生物学教研室，贵州 遵义 563099）

目的：建立 Matrigel卵巢癌细胞三维培养模型，观察Matrigel三维培养条件下卵巢癌细胞的形态、功能及增殖状况。方法：Matrigel三维培养卵巢癌细胞，采用倒置显微镜观察卵巢癌细胞的生长情况，鬼笔环肽/DAPI染色观察细胞形貌，钙黄绿素AM染色评价细胞活力，通过测定DNA含量了解细胞增殖情况，ELISA检测血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和胰岛素样生长因子1 （insulin-like growth factors 1，IGF1）等卵巢癌相关因子的分泌情况。结果：与二维培养条件相比，卵巢癌细胞在 Matrigel中成团生长，且活力及增殖状态好，并能较好地分泌卵巢癌细胞相关因子。结论:Matrigel三维培养体系能较好地维持卵巢癌细胞的形态、功能及增殖能力。

三维培养；Matrigel；卵巢癌细胞

CAI Guo-hui，HAN Yun-zhu，TANG Fu-shan，SONG Hong
（Department of Microbiology，Zunyi Medical College，Zunyi Guizhou 563099，China）

［Abstract］Objective:To establish the three-dimensional（3D）culture model of ovarian cancer by means of Matrigel as scaffolds and to study the cellular morphology，function and proliferation.Methods: The morphology，distribution and viability of ovarian cancer cells in three dimensional culture were identified by fluorescence microscopy；Phalloidine/DAPI staining was used to assess the cellular morphology；The cell viability was measured by calcein AM staining；the cell proliferation was measured by measuring the content of DNA in cells；ELISA assay was used to assess the secretion status of associated factors（VEGFA，EGF and IGF-1）in ovarian cancer cell.Results:Cells grown in Matrigel formed multicellular colonies and good ability and biocompatibility with the matrix.The associated factors（VEGFA，EGF and IGF-1）in ovarian cancer cells assay indicated that there were significant differences of their secreation in three dimensional culture compared to two dimensional culture.Conclusion:Three dimensional culture of ovarian cancer cells in Matrigel matrix could maintain the cells morphology，function and proliferation better.

［Key words］three dimensional culture；Matrigel；ovarian cancer cells

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，死亡率居女性生殖系统恶性肿瘤的第1位，5年生存率仅为 30％左右［1］。由于卵巢癌病理类型复杂，体内直接研究卵巢癌细胞的生物学特性受多种因素的影响，因此，建立一种模拟体内卵巢癌细胞生长微环境的培养模型对体外研究卵巢癌的发生、发展尤为重要［2］。体外细胞三维（three-dimensional，3D）培养是介于二维（two-dimensional，2D）培养与动物实验之间的实验技术，不仅可满足体外研究的直观性及条件可控性，而且能模拟体内细胞生长的三维形态结构和功能［3］。目前已有多种动物来源及人工合成的支架材料用于体外细胞三维培养［4］。本研究以Matrigel作为支架材料，建立卵巢癌 A2780和人高转移卵巢癌 HO8910PM细胞株三维培养模型，观察三维培养下两株卵巢癌细胞的生长情况、细胞活力和增殖情况，并检测血管内皮生长因子 A（vascu-lar endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）和胰岛素样生长因子1（insulin-like growth factors 1，IGF1）等卵巢癌相关因子的分泌情况，为今后卵巢癌体外研究奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清美国 Gibco公司）；人卵巢癌 A2780细胞系购自南京赛博生物科技有限公司，人高转移卵巢癌HO8910PM细胞株购自美国模式菌种收集中心ATCC）；Matrigel（美国BD公司）；DNA荧光定量检测试剂盒、DAPI、罗丹明鬼笔环肽、钙黄绿素 AM均为美国Sigma公司产品；ELISA试剂盒（美国Uscn公司）。

1.1.2 主要仪器 3131型 CO2培养箱和 3001-1913型 Varioskan Flash（美国 Thermo公司），IX71型荧光倒置荧光显微镜、酶标仪（日本奥林巴斯公司）。

1.2 方法

1.2.1 单层细胞培养 0.25％胰酶消化细胞，于37℃，5％CO2及饱和湿度常规培养，待细胞融合至80％时，消化细胞进行下一步实验。

1.2.2 三维细胞培养 取生长状态良好的单层培养细胞，0.25％胰酶消化，调节细胞密度为 2×106/ mL，冰浴下按1∶1比例与Matrigel混合后快速接种于24孔板内的自制模具中，37℃孵育30 min后取出模具，向24孔板中加入适量完全RPMI-1640培养液，37℃，5％CO2及饱和湿度常规培养，隔天换液。1.2.3 细胞形貌观察 每日在倒置显微镜下观察Matrigel中卵巢癌细胞形态及增殖情况并拍照，在培养第6天取细胞 凝胶团，用预温PBS洗涤2次，4％低聚甲醛常温固定15 min，PBS洗3次，0.1％Triton X-100处理5 min，PBS洗3次，将8 μg/mL罗丹明鬼笔环肽加入细胞样品中作用 20 min，PBS洗涤后向细胞样品中加入适量0.5 μg/mL DAPI，室温孵育5 min，吸弃多余液体，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.4 钙黄绿素 AM染色检测细胞活力 细胞在Matrigel基质中分别培养 3，6，9 d，预冷的 PBS洗 3次，每次15 min，以去除或稀释血清中的酯酶活性。取2 μmol/L的钙黄绿素AM工作液添加到三维细胞培养凝胶中至完全淹没凝胶，室温孵育45 min，荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.5 DNA含量测定法评价细胞增殖 0.25％胰酶消化细胞，调整细胞密度在（0～25）×106/mL范围内至少 5个浓度点，置于含 5×10-3mol/L枸橼酸钠和100×10-3mol/L氯化钠的枸橼酸盐缓冲液中，-80℃反复冻融、振荡直至完全溶解，按DNA荧光定量试剂盒说明书测定 DNA含量，以细胞密度为纵坐标，所得 DNA含量为横坐标绘制校正曲线。三维培养卵巢癌细胞到第3、6、9天时，PBS漂洗 2次，取出细胞 凝胶团置于枸橼酸盐缓冲液中，-80℃储存备用。实验前反复冻融并振荡直至完全溶解，测定DNA含量，根据细胞密度与 DNA含量之间的校正曲线计算细胞量。

1.2.6 ELISA检测VEGFA、EGF和IGF1的表达

Matrigel三维培养卵巢癌细胞，到第4天时更换培养液，每孔加800 μL完全 RPMI-1640培养液，到第6天时，取出细胞培养液，2 000×g离心 20 min，取上清液分装到1.5 mL EP管中备用。按照ELISA试剂盒说明书对样本进行处理，酶标仪检测450 nm波长处的光密度值，并与二维培养细胞作对比。

1.3 统计学方法

应用SPSS 13.0统计学软件。所有实验均重复3次以上，计量资料用 ¯x±s表示，组间比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形貌

通过倒置显微镜观察卵巢癌细胞单层培养及在Matrigel基质中的生长形态。单层培养条件下卵巢癌细胞4 h开始贴壁，24 h完全贴壁，细胞呈多边形，培养2～3 d细胞融合可达 80％，4～5 d可达100％融合，第6天以后大部分细胞开始老化，脱落。与单层培养卵巢癌细胞明显不同，在 Matrigel基质中细胞均匀分布于基质材料中，到第 3天时细胞开始形成明显的不规则状细胞团，随着培养时间的延长，细胞团逐渐增大，培养液内未见漂浮的死细胞，见图1。三维培养 6 d后鬼笔环肽/DAPI染色可明显分辨Matrigel中卵巢癌细胞的形貌:红色部分为细胞骨架的F-肌动蛋白（F-actin），蓝色部分为 DAPI染色的细胞核。提示Matrigel三维细胞培养模型的建立使得卵巢癌细胞在细胞外基质微环境中形成了具有三维梯度的多细胞群，见图2。

图1 卵巢癌细胞单层培养及在 Matrigel中培养的明场图（×100）

图2 卵巢癌细胞在 Matrigel中培养第 6天的 F-肌动蛋白及细胞核的荧光复染图（×200）

图3 Matrigel中培养的卵巢癌细胞钙黄绿素AM荧光染色（×100）

2.2 细胞存活力

三维培养第3、6、9天进行钙黄绿素 AM染色可见，随着培养时间的延长细胞团逐渐增大，处于不同梯度的细胞均呈现绿色荧光，提示 Matrigel基质中，不同层次的细胞基本存活，且生长状态较好，细胞与材料具有良好的生物相容性，见图3。

2.3 细胞增殖结果

实验结果显示，Matrigel三维培养体系中，随着培养时间的延长，细胞量显著增加，提示卵巢癌细胞在Matrigel基质中细胞活力较好，与倒置显微镜下观察结果相一致，见图4。

2.4 Matrigel中卵巢癌细胞相关因子的表达

实验结果显示在Matrigel三维培养体系中2株卵巢癌细胞均能分泌调控因子VEGFA、IGF1和EGF。与单层培养细胞比较，Matrigel三维培养下HO8910PM细胞 VEGFA、EGF的分泌量均明显增高P＜0.05）；A2780细胞 VEGFA分泌量明显增高（P＜0.05），见图5。

3 讨论

传统的细胞培养法多采用玻璃或塑料的二维平面培养。实际上许多细胞从组织中分离并进行二维平面培养后，会逐渐平面化、异常分化甚至失去分化表型［5］。因此这种培养法不能真实地反映细胞在体内的生长情况。随着科学技术的发展，人们逐渐认识到，细胞的生长、分化、增殖及凋亡等一系列生命活动受到细胞外微环境的影响［6-8］，这使得细胞培养技术得到不断地改进。近年来，越来越多的研究表明三维培养比二维培养更能真实地反映细胞在体内的生物学行为［9］。然而，至今体外三维细胞培养技术还没有公认的理想方法。

图4 卵巢癌细胞在 Matrigel中的增殖密度

图5 卵巢癌细胞二维及 Matrigel培养6 d相关因子的表达

细胞培养支架是影响体外三维培养的关键因素之一。目前用于肿瘤细胞三维培养的支架材料主要有多微孔支架及纳米纤维支架。多微孔支架使用方便，但其孔径（10～100 μm）远大于细胞平均直径（5～30 μm）。因此，附着于多微孔支架材料上的细胞实际上并没有与材料充分接触，培养细胞其实仍处于二维微环境中；而纳米纤维支架虽能更好地模拟体外细胞生长的微环境，但其力学性能有时很难达到使用要求［10-12］。Matrigel是一种孔径大约在20～50 nm的水凝胶基质，为 Kleinman等于1983年从Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤组织中提取的一种细胞外基质蛋白，后来被命名为Matrigel，其主要成分为层黏连蛋白Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖及巢蛋白，这与胚胎基底膜类似，因此可以促进多种细胞的分化［13］。此外，Matrigel还具有良好的成胶性及适宜的机械性能，在液态时可包裹细胞，固态时可形成交联网络，使大量细胞均匀分散黏附于其中，并能充分接触到细胞基质，更好地模拟了体内细胞生长的微环境。

本研究结果表明，两株细胞均匀分布于Matrigel基质中，呈近圆形，随培养时间的延长可形成不规则状细胞团，并能保持良好活性。此外，两株卵巢癌细胞均能较好地分泌卵巢癌相关因子，与二维培养相比，两株细胞VEGFA分泌量均明显增高，HO8910PM细胞株中EGF分泌量也明显增高。这些提示卵巢癌细胞在 Matrigel三维培养下能长时间保持其原有生物学特性。而在二维培养条件下，由于外在添加的可溶性因子通过充分混合、自由扩散便可快速均衡分布，细胞 24 h内就可以完全贴壁，呈多边形，培养2～3 d细胞融合就可达 80％，但在培养第6天以后大部分细胞开始老化、脱落。这说明在二维培养体系中只能研究一些短暂动态的细胞行为变化。而观察长期的、与形态变化相关的过程，则需要该培养体系中与细胞生长有关的效应分子能维持数小时甚至数天的时间。卵巢癌细胞置身于Matrigel三维微环境中，基质的结构特性如孔径、纤维连接等均可减慢可溶性因子的扩散［14］，并长时间维持这种梯度分布的稳定性，有利于体外长时间观察卵巢癌细胞形态变化相关的过程，也为体外卵巢癌耐药性研究和细胞信号通路的研究提供了实验基础。

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Growth status of ovarian cancer cells in Matrigel three dimensional culture model

R737.31

A

1671-7783（2015）01-0014-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y140289

国家自然科学基金资助项目（81160290）

蔡国徽（1992—），女，硕士研究生；宋鸿（通讯作者），博士，副教授，硕士研究生导师，E-mail:song-77@qq.com

2014-11-12 ［编辑］何承志