广西优质黄皮种质资源ISSR分子遗传多样性分析

王惠君 ，卢 诚 ，黎 明 ，陈 友

（1.琼州学院商学院，海南 三亚 572022；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

早在90年代石健泉[1]、熊子成[2]对广西黄皮种质资源进行过调查，之后的20a间对黄皮的研究大都在黄皮果的营养价值[3]、化学成分[4-5]、栽培技术[6-7]、开发利用[8]等方面。随着当代社会快速发展，原有的优良黄皮种质资源不能满足于市场的需求，迫切需要对原有优良黄皮品质进行改良，尤其是黄皮果果品品质的储运方面缺陷成为黄皮产业的瓶颈，同时广西各地黄皮资源的质量性状参差不齐[9-12]，且果实口味各不相同，黄皮原材料将很难大规模开发利用。利用分子辅助育种方法用于发掘优良品质资源或改良有部分缺陷的优良资源在现代栽培种植中就显得具有紧迫性。分子遗传多样性方面的研究比较薄弱，综合比较各类分子标记的优势，本研究选用操作简便具有较好的重复性且多态性较为丰富的ISSR[13-16]标记技术做黄皮亲缘关系和遗传多样性分析，为今后的品种选育和分子辅助改良育种提供一定的分类依据。

1 材料与方法

1.1 材料

24份黄皮种质，如表1所示。

1.2 方法

1.2.1 ISSR-PCR扩增反应体系的建立

基因组DNA采用实验室成熟的方法改良CTAB法[17]提取，通过正交实验方法对ISSR-PCR扩增反应进行优化后建立20μL反应体系，其中ISSR引物为UBC公布的序列[14]。反应体系如下：Taq酶量1.5U，DNA模板为50ng，引物浓度为 0.5μmol/L，dNTPs浓度为 0.3mmol/L，Mg2+浓度为2.0mmol/L，最后用超纯水补充至20μL。扩增反应程序如下设置：预变性温度/时间-94℃/5min；变性温度/时间-94℃/35s；退火温度/时间-50℃/60s；延伸温度/时间-72℃/90s，37 个循环，最后延伸-72℃（10min），扩增产物将贮存于4℃条件下。

表1 24份黄皮种质信息

1.2.2 数据的分析和处理

呈现为显性标记的ISSR分子标记，在数据分析时根据该分子标记特点的迁移率及有无来统计，无条带统计为0，有条带统计为1，强、弱条带均统计为1，将数据以“0，1”输入Excle 2003文档中构建矩阵数据，统计出总带数、多态性条带数、各引物多态性比率。用生物学NTEDIT软件将该矩阵数据转换为可用于聚类分析软件NTSYS-PC分析的NTS矩阵数据格式，然后将计算得出的遗传相似系数数据按照UPGMA方法进行聚类分析，绘制出该物种的树状聚类图。

2 结果与分析

2.1 多态性分析

该实验从96个引物中，筛选出18个多态性丰富、重复性好的ISSR引物对所收集的24份黄皮优质种质资源的基因组DNA进行多态性检测。结果如下：共扩增出的条带172条，其中多态性条带105条，多态性比率为61.0%。各引物平均能够扩增出9.56条多态性条带，扩增位点最少的引物是GXHP-8，其位点数为6，其中扩增位点最多的引物是GXHP-6，其位点数为17。实验表明所供黄皮实验材料多态性丰富。18条ISSR引物产生的多态性条带详见表2、图 1。

表2 18条ISSR-PCR引物扩增结果

图1 GXHP-3引物对24份优质黄皮品种ISSR-PCR扩增结果

2.2 聚类分析

通过所选ISSR-PCR引物组合扩增所得到的带纹结果进行统计后转换并获得172个标记的矩阵数据。将用构建的矩阵数据导入NTSYS-PC软件计算得到24份黄皮优良品种种质材料相关的遗传相似系数（GS）详情见表3。参照UPGMA聚类分析方法计算出所测定材料的亲缘关系图谱（如图2所示）。24份优质黄皮品种间的遗传相似系数取值范围在0.660～1.000区间。南宁无核（1）、钦州无核（12）、玉林无核（7）、防城港无核（24）、河池无核（18）品种间相似度较高，遗传相似系数在0.961以上。其中钦州无核（12）和南宁无核（1）之间的遗传相似系数为1.000。山黄皮品种与其他品种间的遗传相似性系数最小为0.660。以上数据可以说明，所搜集的24份优质黄皮种质之间的亲缘关系除了山黄皮外其他各品种的亲缘关系相对较近。当遗传相似系数为0.718时将黄皮优质品种资源分为3个大的群体，各个大的群体又包含不同的品种。其中第I大群体包括了4品种，由独核、无核、水晶、牛奶组成；在第II大群体里由大圆头、卵形、鸡心形3个品种。在第III群仅有山黄皮1个品种。

3 讨论

在I群体中包含独核、无核、水晶、牛奶4个品种。在遗传相似系数为0.96时，来源于5个不同地方的无核黄皮聚合在一起，其中来源于钦州无核和南宁无核黄皮GS系数为1.000。钦州无核在广西栽培最多，极有可能南宁无核是从钦州引种的。当遗传相似系数为0.931时，无核与独核品种聚合在一起，说明这两个品种遗传背景较为相似，间接说明无核很有可能是独核的一个变种。要想确定这两个品种的具体关系还要做进一步的研究。当遗传相似系数为0.828时独核和无核与水晶聚合在一起，说明独核、无核与水晶的遗传背景较近；当遗传相似系数为0.795时，独核、无核、水晶与牛奶聚合在一起。其中同一品种牛奶黄皮品种由于来源不同，遗传相似系数较远，很有可能是由地域阻隔等外界因素的影响对遗传背景产生的变异。在II群体中包含有大圆头、卵形和鸡心黄皮3个品种。虽然有地域上的差异，但是从整体上看都是以相同品种的黄皮首先聚合在一起。其中只有一个鸡心黄皮品种有交叉，在遗传相似性系数为0.836时河池鸡心（20）与卵形、大圆头黄皮聚合在一起，当遗传系数为0.782时河池鸡心（20）、卵形、大圆头与南宁鸡心（5）和玉林鸡心（10）聚合在一起。在进化地位上推断，很有可能卵形和大圆头是由鸡心品种进化而来。要想明确具体进化情况要做进一步的研究。在III群只有山黄皮一个品种，在南宁山黄皮（6）和梧州山黄皮（18）遗传相似系数在0.893时才聚合，同时也可以说明由于山黄皮属于小众水果，有的山黄皮资源属于半野生状态，由于地域的阻隔，遗传基因交流也相对较少。山黄皮与黄皮属于同一个属但不同种，在聚类分析的数据结果中山黄皮与其他各类黄皮的遗传相似性系数为0.660，相似性相对较小，这一结果与传统的形态学标记分类相吻合，也为山黄皮与黄皮的亲缘关系提供了科学的技术支持。由于山黄皮与黄皮的遗传的差异性相对较大，因而山黄皮可以作为优质黄皮品种改良的潜在基因库。

表3 24份黄皮优质品种种质间遗传相似性数据

图2 基于ISSR标记的24份品种材料的UPGAME聚类分析图谱

品种遗传改良的各种方法中，作为最为原始的人工杂交方法是最为有效的。如果遗传背景较为复杂的条件下，凭借传统的方法如形态学标记、生化标记、细胞标记等方法还余存较多的争议，无法判断两两品种之间的遗传背景现状。因而传统遗传改良育种方法带有盲目性。为了解各个品种之间的亲缘关系，我们可以采取分子标记的方法，快速的对所提供的优良品种在分子水平进行分析各品种之间的亲缘关系。利用亲缘关系较远的品种间进行遗传改良育种，为今后更有目标、有预见的引种和育种，进而缩短育种年限和提高育种效率提供理论依据，同时也可为所研究品种间的亲缘关系和进化地位提供佐证。在此试验中选择的广西各地主要推广的8个优质黄皮品种种质资源进行分析，从所得的聚类分析结果上与传统的形态学分类方法大致相同。

4 结论

在96个的ISSR-PCR引物中筛选出18个具有重复性和多态性较好引物，对24份优质推广黄皮品种种质资源材料进行ISSR分子标记技术分析，共获得172个位点，其中的105个是具有多态性的，多态性比率为61.0%。在遗传相似性系数为0.718时将24份黄皮品种种质资源分为3个大群。该试验结果不仅在黄皮形态学上分类鉴定提供了佐证，也为优质黄皮品种间的亲缘关系给予初步鉴定，为优质黄皮品种种质资源的开发研究领域提供新的方法。

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