咳喘颗粒HP L C指纹图谱研究

2015-09-07刘德贤陶遵威

中国当代医药 2015年4期

刘德贤陶遵威张婷张岩

1.天津中医药大学，天津 300073；2.天津医药科学研究所，天津 300020

咳喘颗粒为院内制剂，由五味子、白芍、甘草、黄芩等14味中药组成，具有解表散寒、温肺化饮之功效，治疗咳嗽、哮喘效果显著，未见相关的指纹图谱报道。中药复方作用特点相辅相成，即多成分、多系统、多靶点的综合效应[1-3]，因此用单一指标成分往往不能达到全面评价和控制复方制剂质量的效果，而指纹图谱由于其具有多指标全面分析的作用[4-5]，已成为评价中药质量的有效方法，并被广泛用于中药及其复方制剂的质量控制研究[6-10]。因此，为了更好地控制咳喘颗粒质量，为临床用药提供依据，本实验采用HPLC方法[11-12]建立咳喘颗粒的化学指纹图谱，着重表达药材的信息。对咳喘颗粒指纹图谱中主要指纹峰进行归属，实现系统、多角度控制咳喘颗粒质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（LC-20AT日本岛津公司），PDA检测器；超声仪（KQ-250B，昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平（ABS135-S，瑞士梅特勒-托利多公司）；电子天平（JJ200，常熟双杰测试仪器厂）。

1.2 试药

芍药苷对照品（批号：1110736-200934，由中国食品药品检定研究院提供）、甘草苷对照品（批号：11610-201106）、黄芩苷对照品（批号 110715-201117）、甘草酸铵对照品（110731-200615）、五味子醇甲对照品（110857-201211），以上五种对照品均由中国药品生物制品检定所提供）；乙腈（色谱纯，迪马科技有限公司），甲醇（色谱纯，迪马科技有限公司），甲醇（分析纯，天津市化学试剂批发公司），乙醇（分析纯，天津市化学试剂批发公司），娃哈哈纯净水（天津娃哈哈宏振饮料有限公司），咳喘颗粒（批号：tl20140507001～tl20140507010，医内制剂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）；流动相 A 为乙腈，流动相B为0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～20 min，10%～15%A；20～30 min，15%～30%A；30～50 min，30%～50%A；50～90 min，50%～90%A；90～100 min，90%～100%A；检测波长237 nm，流速1.0 ml/min，分析时间75 min，进样量 10 μl。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芍药苷、甘草苷、黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲对照品适量，加甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为 0.05、0.1、0.04、0.085、0.18 mg/ml的混合对照品溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取咳喘颗粒约5.0 g，置50 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，回流提取60 min，放冷，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.4 系统适用性试验

分别取供试品（tl20140507001）和对照品溶液进样，记录237 nm波长下色谱图。对保留时间和紫外光谱图进行对比可知 6、7、10、15、16 号峰分别是芍药苷、甘草苷、黄芩苷、甘草酸铵、五味子醇甲。10号峰（黄芩苷）10批供试品均有，峰型好，峰位适中，与相邻峰分离良好。因此作为参照物峰，如图1、图2。在此条件下，理论塔板数以黄芩苷计算＞2500。

图1 批号（tl20140507001）样品HPLC色谱图

图2 对照品HPLC色谱图

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验精密取样品（tl20140507001）溶液，连续进样6次，按“2.1”项色谱条件测定，考察各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.51%，相对峰面积的RSD为1.24%～2.76%，表明仪器精密度良好。

2.5.2 稳定性试验精密取样品（tl20140507001）溶液，分别于 0、4、8、16、24、48 h，按“2.1”项下色谱条件测定，以10号峰（黄芩苷）为参照峰，考察各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.04%～0.46%，相对峰面积的RSD为0.78%～2.12%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.5.3 重复性试验取样品（tl20140507001）溶液，精密称取5份，按照“2.3”下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以10号峰（黄芩苷）为参照峰，考察各色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性。结果，各色谱峰相对保留时间的RSD为0.03%～0.37%，相对峰面积的RSD为1.05%～2.47%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.6 标定共有峰

对10批咳喘颗粒进行检测，记录色谱图，以共有率100%记，共有16个共有峰，10批咳喘颗粒HPLC图谱各共有峰相对保留时间除11号（1.5189）、13号（1.7136）、14 号（2.6392），其余均<1.0，符合指纹图谱要求，结果见表1、表2。

2.7 建立指纹图谱共有模式

将10批咳喘颗粒HPLC色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版），以S5为参照，采用中位数法生成对照图谱和共有模式图谱，如图3。

图3 10批咳喘颗粒样品HPLC色谱图

表1 10批样品的共有峰的峰面积

表2 10批样品指纹图谱相对保留时间

2.8 指纹图谱相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004A版）对上述10批咳喘颗粒样品进行特征图谱相似度计算，结果见表3。结果显示，10批咳喘颗粒相似度评价结果均＞0.96，直观说明各批次咳喘颗粒之间无明显差异性，本方法可用于鉴别咳喘颗粒的整体质量。

表3 10批样品指纹图谱相似度计算结果

3 讨论

3.1 指纹图谱检测波长的确定

考察了咳喘颗粒主要成分，参照相关文献[13-21]，分别对 210、237、250、294 nm 进行筛选。 210、290 nm 出峰较少，且出峰时间较晚。250 nm出峰较多，但是基线漂移。237 nm时出峰多、分离度好、基线平，因此选237 nm为检测波长。

3.2 流动相的选择

本实验首先对等度洗脱与梯度洗脱进行选择，结果等度洗脱分离度不如梯度洗脱好，因此选择梯度洗脱。其次，对甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水四种流动相进行选择，结果甲醇-磷酸、乙腈-磷酸峰型较甲醇-水、乙腈-水好，且基线平，乙腈-磷酸较甲醇-磷酸出峰多。因此，流动相选择乙腈-磷酸梯度洗脱。

3.3 提取条件的选择

本实验首先对不同提取方法（超声提取方法和加热回流提取方法）进行选择，结果回流提取较超声提取出峰多且峰型好，因此选择回流提取。其次对提取溶剂进行选择，样品分别加50 ml 25%甲醇、25%乙醇、50%甲醇、50%乙醇、75%甲醇、75%乙醇、纯甲醇、纯乙醇溶液加热回流提取，结果50%甲醇提取出峰最完全，分离度最好，所以选择50%甲醇提取。最后考察提取时间，分别用 50%甲醇回流提取 15、30、45、60 min，结果超声30 min，样品出峰最完全，所以选择30 min。因此，最终提取条件为50%甲醇回流提取30 min。