微藻高CO2耐受机制及其在生物减碳领域的应用

李凤娟，高大文，胡晗华

(1.城市水资源与水环境国家重点实验室(哈尔滨工业大学)，150090哈尔滨;2.中国科学院水生生物研究所藻类生物学重点实验室，430072武汉)

随着工业的进步，人类过度依赖化石燃料，造成CO2排放量大增，导致环境恶化.作为主要的温室气体，全球CO2排放量迄今已达290亿t/a，大气中 CO2的质量分数也由 0.027%上升至约0.04%［1］.面对愈发严重的温室效应及减排需求，国内外针对CO2减量开展了许多研究，而生物法固碳作为固碳处理技术之一，是减碳的重要方向.其顺应自然法则，所需能源来自太阳能，具有安全、经济、高效等优点，是目前环境友好型CO2减排的重要方法之一［2］.目前生物固碳的两个大方向为植物固碳和微藻固碳，而利用后者进行CO2封存被认为是降低CO2水平最环保、安全和可持续的方式.微藻生长周期短、光合效率高［3］，可以完全回收CO2，减少CO2排放的同时降低了培养成本.此外，微藻含油量高，还可积累多种活性物质(蛋白质、多糖和色素等)，开发潜力巨大.同时，CO2的微藻生物减排结合其他过程如污水处理可以变得更经济，在环境上又是可持续的［4］.由此可见，藻类在生物固碳领域具有相当广阔的应用前景.使用来源于煤-热电厂烟道气中的CO2培养微藻已经有了成功的尝试［5］.然而，由于对微藻生物减排CO2生理效应和高水平CO2驯化机制认识不足，在发展高效生物减排CO2的方法时遇到了很大难题.

微藻固碳领域的绝大多数研究都致力于CO2浓缩机制(CCMs)和相对较低CO2水平(＜5%)对微藻的影响.尽管微藻耐受高CO2水平这一现象已被发现超过40年［6］，其机制方面的研究仍然很少.高CO2耐受/驯化是个复杂的过程，涉及微藻细胞众多功能的调整.了解其基本机制是富集CO2以增加大规模微藻培养的生产力，进而实现碳捕获和生物质生产的先决条件.为此，从利用微藻进行高效固碳的优势出发，综述了微藻对高CO2耐受的机理，以期为更好地利用微藻进行高效CO2减排提供理论依据.

1 微藻高效固碳的基础

核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)是藻类及高等植物的固碳关键酶，它的进化出现在24～38亿年前，是地球历史上的高CO2年代.当今约0.04%的大气CO2质量分数是光合作用的限制因素，而光自养生物进化出了复杂的CCMs.通过这种机制促进CO2的吸收，使得RubisCO附近CO2的质量分数相对于大气的水平增加1～3个数量级，以保持充分的光合作用［3］.因此，较低的CO2质量分数，比如2%～5%对于绝大多数当代光合自养生物是饱和的，而较高的CO2水平往往对其生长和光合作用有害.正是由于微藻RubisCO起源的年代大气CO2水平比当今要高得多，使其具有低的CO2亲和力，从这一角度看，微藻可以被认为是高CO2适应/驯化细胞［7］.有些生境CO2质量分数可以在大气水平和高至10%之间急剧变化，如土壤表面和酸性环境等.因而，即使在现今CO2水平下，高CO2适应对微藻仍然具有重要的生态学意义.

基于微藻对CO2质量分数的耐受性可以简单地将其分成CO2敏感和CO2耐受两种类型.CO2敏感型(不耐受)的种类在通入小于2%～5%CO2时生长和光合作用即被抑制.耐受型的种类能够应付5%～20%CO2，能够耐受更高CO2质量分数的物种被称为CO2极耐受型.尽管CO2极耐受型微藻并不多见，地球多变的生境及微藻广泛的分布使发掘出不同特性CO2耐受藻株成为可能.目前，用于研究微藻对高CO2耐受的几个常用物种包括小球藻属 (Chlorella)、栅藻属(Scenedesmus)、微拟球藻(Nannochloropsis)和绿球藻属(Chlorococcum)的种类，研究的CO2质量分数高至100%［8-9］.通常，从极端环境中分离的物种能在很高的CO2水平(如＞40%)下快速增长，有的甚至在CO2超过60%时生长才受到抑制［10-11］.分离自酸性环境的微藻，由于 CO2是主要的碳源，没有胞外碳酸酐酶(CA)，这种高CO2环境下生长/驯化的细胞通常缺乏CCMs，但其RubisCO有相对较高的CO2亲和力，细胞通过利用跨细胞膜的pH梯度来促进CO2的扩散吸收，以保证光合作用所需的CO2得到充足的供应.在通入高CO2时，藻细胞可能先经历一个延迟期，此时的生长速率明显低于空气培养条件时的细胞，CO2固定也下降，随后，藻的生长速度加快.延迟期的长短与藻种及实际通入的CO2质量分数有关［12］.

2 微藻耐高CO2的可能机制

2.1 细胞内pH动态平衡的加强

高CO2条件下观察到的光合作用的快速抑制，可能是由高CO2压力下叶绿体间质的酸化引起卡尔文循环的关键酶失活所致.Pronina等［13］的研究表明，海滩绿球藻(Chlorococcum littorale)即使在高达40%的CO2水平下培养，其细胞质中的pH也没有低于7.0.显然，如何有效控制细胞内的pH对于高CO2耐受至关重要，这种控制可以通过从细胞质泵送质子进入液泡来完成.研究证实，高CO2可以导致微藻细胞质中的液泡大小和/或数目增加，同时伴随着H+-ATP酶活性显著增强［14］.此外，对于 CO2耐受种，还可以通过对硝酸盐的吸收提高培养基中的pH.对赫氏颗石藻(Emilianiahuxleyi)和一种共生链带藻(Desmodesmussp.)的研究表明，细胞通过吸收硝酸盐以使培养基碱化，从而缓解高浓度CO2酸化产生的不利影响［15］.由此可见，高 CO2驯化以及利用微藻培养捕捉烟气CO2，充足的NO3-供应是必须的.

将耐高CO2的海滩绿球藻转至40%的CO2水平培养1 h，细胞内的pH就会下降［9］，而加入胞内CA抑制剂后这种效应可被消除.CA作为CCMs的一个主要成分，其活性的抑制将导致CCMs的完全或部分关闭.抑制或下调CCMs将使得碳酸氢盐的利用受阻，减少由此导致的胞内pH的降低.许多研究显示可耐受高质量分数CO2的微藻明显缺乏CCMs.因此，迅速下调或关闭CCMs也是微藻适应高CO2水平的一个重要方式.

2.2 光合器官(PSA)的驯化

分离自盐水池塘的海滩绿球藻能在高达60%CO2水平下快速生长.研究表明，将这种绿球藻转移到高 CO2条件时，藻细胞 PSA(photosynthetic apparatus)发生了由状态I到状态II的快速转换，光系统(PS)I的循环电子传递增加，以生成维持藻细胞pH动态平衡所必需的额外 ATP［16］.PSA 状态转换的一个常见原因是NADPH的积累导致的质体醌库的减少，这种情况通常是由于一种压力因素(如CO2质量分数升高)将光合作用暗反应抑制到一定程度而产生［17］.因此，PSI/II比率的增加表明，高 CO2耐受性需要增加PSI捕光天线的大小.事实上，在转移到高CO2条件的几天内，相应的变化已经在高CO2耐受微藻的 PSA中观察到［12］.值得注意的是，该PSI/II比率的变化是可逆的，可以回到其初始的水平，这可能是由于微藻细胞整体驯化到高CO2或CCM的活性下降，导致对ATP的需求减少.与此相反，不耐受高 CO2的杜氏盐藻(Dunaliella salina)缺乏状态转换的响应，而且在高CO2条件下出现 PSI损伤［18］.另外，与在大气CO2水平培养相比，CO2质量分数升高可减轻高CO2耐受的蛋白核小球藻 (Chlorella pyrenoidosa)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)高光诱导的光抑制，且从光抑制恢复的速度更快.相反，CO2敏感型的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)光抑制在这种条件下更为明显［7］.

2.3 脂肪含量及组成的调整

通常认为，适度增加(2%～5%)CO2质量分数可以促进微藻细胞的生长及脂质积累［19］.当CO2水平从 0.04%增至 5%时，一种栅藻(Scenedesmus obtusiusculus)细胞的中性脂质量分数从15%提高到55%，相应地碳水化合物减少［20］.对其他许多绿藻的研究也得到相似的结论［21］.对 CO2耐受种而言，脂质(特别是甘油三酯)可以作为过剩光合固碳产物的一个库，过量的CO2最终流向脂质的合成.由此看来，脂质合成代谢与CO2耐受密切相关.然而，不同藻种脂质变化对高CO2的响应存在差异，特别是当CO2质量分数超过10%后，提高CO2质量分数并不总是能增加细胞的总脂含量.研究表明，在高CO2耐受的栅藻中，提高CO2质量分数到20%，总脂含量减少，但中性脂和胞内游离脂肪酸的含量增加.高质量分数CO2条件下，从头合成脂肪酸受到促进，总脂肪酸含量显著升高，这些脂肪酸可能流向脂酰基最终形成甘油三酯，也可能在细胞内积累.

除总脂或总脂肪酸含量的变化，提高CO2质量分数还会引起脂质和脂肪酸组成的改变.Tang等［22］的研究显示，增加CO2质量分数促进C18多不饱和脂肪酸的合成.与这一结论相反，对一种CO2敏感的盐藻的研究表明，短期的高CO2质量分数处理抑制脂肪酸的延伸与去饱和.在高CO2条件下，由于脂肪酸修饰酶类的活性可能维持不变，并不足以转换过量涌入的从头合成脂肪酸.由此导致盐藻细胞主要的半乳糖脂——单半乳糖二酰甘油酯(MGDG)中的C16饱和脂肪酸和C18单不饱和脂肪酸的比例增加.MGDG中饱和脂肪酸含量的增加可能改变细胞的膜结构.

3 微藻高CO2响应的分子机制

如上所述，微藻可以通过改变其光合特性如CCMs来适应高CO2条件.高CO2条件下生长的一些绿藻通过丧失CA和无机碳主动运输系统来下调CCMs，以避免因过量无机碳积累引起的二次抑制效应.对莱茵衣藻的研究表明，高CO2下藻细胞胞外蛋白质组成发生了急剧的变化［23］.蛋白质组学的分析显示，高CO2诱导许多配子发育相关蛋白质的表达，但其与高CO2耐受的关系并不清楚.一种可能的解释是，高CO2下生长的细胞需要更多的氮源，往往容易达到氮限制状态，在此条件下光呼吸的抑制将减少氮的固定，由此NH4+水平降低.细胞内NH4+水平的下降可以诱导莱茵衣藻配子发生相关基因的表达.

此外，对蓝藻的研究表明，CO2质量分数与无机氮同化有密切的联系，可能影响细胞对氮的吸收.聚球藻 (Synechococcussp.)PCC7942高亲和碳酸盐转运子cmpABCD的分子结构与硝酸盐/亚硝酸盐转运子nrtABCD非常相似［19］.高亲和硝酸和亚硝酸盐转运子(HANT/HANiT)的表达是由低CO2而不是NH4+触发的［24］.因而，在利用 CO2时必须考虑无机氮的影响.

除胞内CA外，许多微藻还有胞外CA.与前面分析相反，衣藻中一个定位于周质腔的α-型CA，CAH2可受高CO2条件诱导.尽管表达量低，受高CO2诱导的机理仍不清楚.衣藻中一个可能与铵和/或CO2转运相关的蛋白Rh1也受高CO2的诱导，Rh1表达下调的衣藻突变体在高CO2条件下的生长受到明显抑制［25］.

与研究较多的低CO2诱导机制相比，微藻在分子水平上对高CO2响应机制的研究才刚刚开始.深入研究微藻对高CO2响应的机制，有助于理解微藻如何响应环境CO2升高，也利于揭示细胞的整个代谢网络如何调控，以合理通过各种手段提高固碳效率，为大规模养殖藻类时最大化高CO2条件下的藻生物量提供理论依据.根据已有的研究进展，Baba等［7］总结了高CO2下衣藻的碳利用及光呼吸.图1显示，高CO2下HCO3-不能直接由胞外转运至胞内，而胞外CA可能上调，碳以CO2的形式经自由扩散或Rh主动运输进入细胞内，胞内的CA可能活性下调或降解，CO2依次进入叶绿体的蛋白核中，在RubisCO作用下固定形成有机物.高CO2下藻细胞的光呼吸受到抑制.

图1 高CO2下莱茵衣藻对碳利用的模式［7］

4 耐高CO2微藻培养的应用

电厂烟道气是 CO2、N2、O2、SOx、NOx和粉尘等的混合物，其中CO2质量分数可达15%［26］，是CO2排放的主要来源之一，占全球CO2排放量的7%以上［27］.通常，SOx和NOx对藻类的培养也有不利影响［28］.如果含高质量分数CO2的烟道气不经预处理直接用于培养微藻，将简化培养程序，同时可降低生产成本.已有利用蓝藻和绿藻进行烟气减排的研究报道，根据这些结果，许多耐高质量分数CO2微藻对中等水平的SOx和NOx(体积分数约 150×10-6)也 具 良 好的 耐 受 性［29-30］.Yoshihara等［31］报道，微拟球藻在通入 100×10-6的NO时可以正常生长.Matsumoto等［32］的研究表明，扁藻 (Tetraselmissp.)可耐受含 185×10-6的SOx和125×10-6的 NOx以及14.1%CO2的烟道气.岳丽宏等［9］筛选出的一株小球藻ZY1可在10%～15%的 CO2环境中保持旺盛生长，还可耐受50×16-6的 SO2和 300×10-6的 NO.CO2生物减排的另一个重要功效是在CO2固定过程中产生的生物质可以被转化为生物燃料.尽管生物燃料生产成本远高于化石燃料，且微藻培养过程中消耗与产出的能量相当，但生物燃料包括微藻生物质在替代减排上的潜力巨大，使得微藻生物质仍被认为是最有前途的生物燃料之一.利用高CO2培养微藻在提高生物量的同时可增加油脂产率，进而控制培养成本.Chiu等［21］的结果表明，半连续系统中的眼点微拟球藻 (N.oculata)在通入5%～15%的CO2质量分数下生长良好，脂质积累从对数期的31%增加至稳定期的50%.Kishimoto等［33］利用CO2作为碳源，培养1周后杜氏盐藻生物产量达1.0 g·L-1，显示出其有效的生物燃料生产和固定CO2的能力.杜氏盐藻是一种嗜盐绿藻，可在无需消毒的高盐度条件(氯化钠水溶液6%)下生长，在大规模培养同时进行CO2减排时具有很大的优势.此外，还可以积累高达10%以上的β-胡萝卜素，为生物减排CO2提供了商业利益的新途径.因而，将生物燃料生产、CO2减排和高附加值的次生代谢物的生产结合起来，是实现利用微藻进行经济减排的有效途径.

另外，微藻CO2的固定还可与废水处理相结合进行.Yun等［34］用从炼钢厂排出的废水培养普通小球藻(C.vulgaris)，当藻类通入15%的CO2培养时，不控制 pH，在废水中补充一定量的磷，CO2固定率可达 0.6 g·L-1·d-1，氨的去除率为22 g·m-3·d-1.市政废水的处理非常昂贵且在技术上有挑战性，微藻培养可以转移污水中的N和P，有助于避免河流与湖泊富营养化的危害.刘玉环等［35］尝试利用高产油栅藻 (Scenedesmus dimorphus)进行市政废水处理和火电厂烟道气利用.结果显示，在高达33.3%的CO2条件下，该栅藻可以高效利用市政废水中的N和P.污水处理和微藻CO2固定的组合，提供了生物固碳，从废水中除去氮、磷和金属，同时获得生物燃料的途径，且无需使用宝贵的淡水资源，既可节约营养物质又可带来环境效益.

5 结语与展望

许多微藻能耐受中等水平的CO2，而能够耐受极端CO2质量分数(20%～40%或更高)的物种不常见.因而，为利用微藻高效捕获CO2，首先需要分离出更多高CO2耐受的微藻种类.欲实现污水处理与微藻固碳的结合，可考虑在污水处理单元分离筛选更快利用氮、磷等营养物的藻种.其次，通过深入研究微藻对高CO2耐受的机制，以利用生理或遗传手段应对高CO2的伤害也是行之有效的方法.

基于高CO2耐受和有效利用温度较高的烟道气考虑，可以从如间歇泉和温泉等极端环境分离藻种.培养时可增加培养基中硝酸盐浓度以及利用基因工程技术下调CCMs等手段增进微藻对高CO2的耐受力，还可进一步改造细胞的脂质代谢，使过剩的光合固碳产物快速贮存在脂质中，提高微藻生物质作为生物燃料的价值.

总之，尽管对微藻高CO2耐受的研究已有一些进展，对其机制的了解还不够深入.利用目前快速发展的“组学”工具可望阐明微藻高CO2耐受的机理，并最终为高效利用微藻固碳提供有力的理论支撑.

［1］邝生鲁.全球变暖与二氧化碳减排［J］.现代化工，2007，27(1):1-12.

［2］司建伟，何少华，周雪飞，等.水生微藻固定空气中CO2的研究进展［J］.环境保护科学，2009，35(5):1-4.

［3］BILANOVIC D，ANDARGATCHEW A，KROEGER T，et al.Freshwater and marine microalgae sequestering of CO2at different C and N concentrations:response surface methodology analysis［J］.Energy Conversion and Management，2009，50(2):262-267.

［4］KUMAR A，ERGAS S，YUAN X，et al.Enhanced CO2fixation and biofuel production via microalgae:recent developments and future directions［J］.Trends in Biotechnology，2010，28(7):371-380.

［5］KOBERG M，COHEN M，BEN-AMOTZ A，et al.Biodiesel production directly from the microalgae biomass ofNannochloropsisby microwave and ultrasound radiation［J］.Bioresource Technology，2011，102(5):4265-4269.

［6］SOLOVCHENKO A，KHOZIN-GOLDBER I.High-CO2tolerancein microalgae:possible mechanismsand implications for biotechnology and bioremediation［J］.Biotechnology Letters，2013，35(11):1745-1752.

［7］BABA M，SHIRAIWA Y.High-CO2response mechanisms in microalgae［J］.Tech Rijeka，2012，2:299-320.

［8］ OLAIZOLA M.Microalgal removal of CO2from flue gases:changes in medium pH and flue gas composition do not appear to affect the photochemical yield of microalgae cultures［J］.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2003，8(6):360-367.

［9］岳丽宏，陈为公，李建国，等.烟气环境条件下小球藻的生长及其 CO2固定［J］.青岛理工大学学报，2005，26(6):15-19.

［10］SATOH A，KURANO N，HARAYAMA S，et al.Effects of chloramphenicol on photosynthesis，protein profiles and transketolase activity under extremely high CO2concentration in an extremely-high-CO2-tolerant green microalga，Chlorococcum littorale［J］.Plant and Cell Physiology，2004，45(12):1857-1862.

［11］徐敏，陈珊，刘国祥，等.极高CO2胁迫对被甲栅藻(Scenedesmus armatus)生理活性和细胞结构影响［J］.植物科学学报，2004，22(5):439-444.

［12］SATOH A，KURANO N，SENGER H，et al.Regulation of energy balance in photosystems in response to changes in CO2concentrations and light intensities during growth in extremely-high-CO2-tolerant green microalgae［J］.Plant and Cell Physiology，2002，43(4):440-451.

［13］PRONINA N，KODAMA M，MIYACHI S.Changes in intracellular pH values in various microalgae induced by raising CO2concentrations［M］.Yokohama:Furuya M(ed)XV International Botanical Congress，1993:419.

［14］SASAKI T，PRONINA N A，MAESHIMA M，et al.Developmentofvacuolesand vacuolarH+-ATPase activity under extremely high CO2conditions inChlorococcum littoralecells［J］.Plant Bbiology，1999，1(1):68-75.

［15］FUKUDA S，SUZUKI I，HAMA T，et al.Compensatory response of the unicellular-calcifying algaEmiliania huxleyi(Coccolithophoridales，Haptophyta)to ocean acidification［J］.Journal of Oceanography，2011，67(1):17-25.

［16］MIYACHI S，IWASAKI I，SHIRAIWA Y.Historical perspective on microalgal and cyanobacterial acclimation to low-and extremely high-CO2conditions［J］.Photosynthesis Research，2003，77(2/3):139-153.

［17］STRASSER R，TSIMILLI-MICHAEL M，SRIVASTAVA A.Analysis of the chlorophyll a fluorescence transient［M］.Dordrecht:Springer，2004:321-362.

［18］MURADYAN E A，KLYACHKO-GURVICH G L，TSOGLIN L N，et al.Changes in lipid metabolism during adaptation of theDunaliella salinaphotosynthetic apparatus to high CO2concentration［J］.Russian Journal of Plant Physiology，2004，51(1):53-62.

［19］BADGER M R，PRICE G D.CO2concentrating mechanisms in cyanobacteria:molecular components，their diversity and evolution［J］.Journal of Experimental Botany，2003，54(383):609-622.

［20］TOLEDO-CERVANTES A，MORALES M，NOVELO E，et al.Carbon dioxide fixation and lipid storage byScenedesmus obtusiusculus［J］.Bioresource Technology，2013，130:652-658.

［21］CHIU S Y，KAO C Y，TSAI M T，et al.Lipid accumulation and CO2utilization ofNannochloropsis oculatain response to CO2aeration［J］.Bioresource Technology，2009，100(2):833-838.

［22］TANG D，HAN W，LI P，et al.CO2biofixation and fatty acid composition ofScenedesmus obliquusandChlorella pyrenoidosain response to different CO2levels［J］.Bioresource Technology，2011，102(3):3071-3076.

［23］BABA M，SUZUKI I，SHIRAIWA Y.Proteomic analysis of high-CO2-inducible extracellular proteins in the unicellular green alga，Chlamydomonas reinhardtii［J］.Plant and Cell Physiology，2011，52(8):1302-1314.

［24］REXACH J，MONTERO B，FERNANDEZ E，et al.Differential regulation of the high affinity nitrite transport systems III and IV inChlamydomonas reinhardtii［J］.Journal of Biological Chemistry，1999，274(39):27801-27806.

［25］SOUPENE E，INWOOD W，KUSTU S.Lack of the Rhesus protein Rh1 impairs growth of the green algaChlamydomonasreinhardtiiat high CO2［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2004，101(20):7787-7792.

［26］MAEDA K，OWADA M，KIMURA N，et al.CO2fixation from the flue gas on coal-fired thermal power plant by microalgae［J］.Energy Conversion and Management，1995，36(6):717-720.

［27］SAKAI N，SAKAMOTO Y，KISHIMOTO N，et al.Chlorella strains from hotsprings tolerant tohigh temperature and high CO2［J］.Energy Conversion and Management，1995，36(6):693-696.

［28］张一昕，赵兵涛，熊锴彬，等.微藻固定燃烧烟气中CO2的研究进展［J］.生物工程学报，2011，27(2):164-171.

［29］MATSUMOTO H，HAMASAKI A，SIOJI N，et al.Influence of CO2，SO2and NO in flue gas on microalgae productivity［J］.Journal of Chemical Engineering of Japan，1997，30(4):620-624.

［30］徐少琨，张峰，向文洲，等.微藻应用于煤炭烟气减排的研究进展［J］.地球科学进展，2011，26(9):944-953.

［31］YOSHIHARA K I，NAGASE H，EGUCHI K，et al.Biological elimination of nitric oxide and carbon dioxide from flue gas by marine microalga NOA-113 cultivated in alongtubularphotobioreactor［J］.Journalof Fermentation and Bioengineering，1996，82(4):351-354.

［32］MATSUMOTO H，SHIOJI N，HAMASAKI A，et al.Carbon dioxide fixation by microalgae photosynthesis using actual flue gas discharged from a boiler［J］.Applied Biochemistry and Biotechnology，1995，51(1):681-692.

［33］KISHIMOTO M，OKAKURA T，NAGASHIMA H，et al.CO2fixation and oil production using micro-algae［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1994，78(6):479-482.

［34］YUN Y S，LEE S B，PARK J M，et al.Carbon dioxide fixation by algal cultivation using wastewater nutrients［J］.Journal of Chemical Technology and Biotechnology，1997，69(4):451-455.

［35］刘玉环，阮榕生，孔庆学，等.利用市政废水和火电厂烟道气大规模培养高油微藻［J］.生物加工过程，2008，6(3):29-33.