蛋白激酶 D1对心肌梗死大鼠心肌组织 eNOS及Ang1表达的调控作用

杨　雷，　毛秉豫，　刘　暖（南阳理工学院　医学实验中心，河南　南阳　473004）

蛋白激酶D1对心肌梗死大鼠心肌组织eNOS及Ang1表达的调控作用

杨雷，毛秉豫，刘暖
（南阳理工学院医学实验中心，河南南阳473004）

目的：探讨蛋白激酶D1（PKD1）对大鼠心肌梗死后心肌组织内皮型一氧化氮合酶（eNOS）及促血管生成素1（Ang1）表达调控的影响.方法：采用冠状动脉左前降支结扎造模方法复制大鼠心肌梗死模型，术后存活达2 d以上的心肌梗死大鼠随机被分为模型组、PKD1处理组与CID755673处理组，每组8只.应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）分析PKD1及其阻断剂CID755673对大鼠心肌组织中eNOS及Ang1 mRNA表达的影响，应用免疫组化法和免疫印迹法分析eNOS及Ang1的蛋白表达.结果：和心肌梗死模型组相比较，PKD1处理组大鼠心肌组织中eNOS及Ang1的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；和PKD1处理组比较，CID755673处理组大鼠心肌组织中eNOS及Ang1的mRNA和蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），接近于模型组水平.结论：PKD1显著上调大鼠心肌梗死后受损心肌组织中eNOS及Ang1的表达.

蛋白激酶D1；心肌梗死；一氧化氮合成酶；促血管生成素1；大鼠

蛋白激酶D1（Protein kinase D1，PKD1）是肿瘤血管形成进程中的关键调控蛋白之一［1－3］，PKD1信号级联反应和胰腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、乳腺癌、前列腺癌等的发生发展密切相关［2－7］，鉴于此，抗PKD1抑制肿瘤血管的成熟而促进肿瘤细胞凋亡的治疗策略引发了学者们广泛的兴趣［5－7］.PKD1既然是肿瘤血管新生的关键调控蛋白之一，是否也在缺血受损的心肌组织中发挥着重要的作用？能否成为心肌梗死治疗的潜在靶点，本实验拟探讨PKD1对大鼠心肌梗死后心肌组织内内皮型一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）及促血管生成素1（Angiopoietin-1，Ang1）表达调控的影响，以“PKD1”为靶点促血管新生疗法治疗心肌梗死提供实验依据.

1　材料与方法

1.1材料

（1）实验动物SD大鼠，购自河南省实验动物中心，雄性，清洁级，8周龄，体质量约200～240 g，动物生产许可证号：SCXK（豫）2010－0002，动物质量合格证号：1000142.

（2）主要试剂PKD1购自美国Pierce公司，生产批号为OSP00005W；PKD1特异阻断剂 CID755673购自美国MedChemExpress公司，生产批号为2011756；逆转录试剂盒购自美国Gene公司，生产批号为AORT-0020/AORT-0050；eNOS、Ang1抗体购自天津恒业生物科技有限公司，生产批号为EL163112；Ang1抗体购自天津赛尔生物技术有限公司，生产批号为SRP00490；羊抗兔IgG、DAB显色液购自武汉博士德生物工程有限公司，生产批号为TC1378和DD1660.

1.2方法

（1）心肌梗死模型建立及分组参照本研究小组之前的研究［1］，采用冠状动脉左前降支结扎造模方法复制大鼠心肌梗死模型.术后存活达2 d以上的心肌梗死大鼠随机被分为模型组、PKD1处理组、CID755673处理组，每组8只.PKD1处理组大鼠按照每天质量分数为10 mg/kg的标准腹腔注射，模型组注射等量的生理盐水，CID755673处理组大鼠在PKD1处理组的基础上按照每天质量分数为10 mg/ kg的标准同时腹腔注射CID755673.连续饲养14 d后处死大鼠.

（2）RT-PCR检测取出－80℃冰箱的冻存管中每只大鼠梗死区的100 mg心肌组织，IKA-T25匀浆机制成匀浆，4℃下12 000 g离心5 min，Trizol法提取总RNA后进行eNOS及Ang1 mRNA转录表达的变化检测.根据Genbank序列，分别设计eNOS及Ang1上、下游引物，eNOS：5′-CTGCTGCCCCAGATATCT-TC-3′，5′-TCCTCCCTGACGTCATGGAC-3′，产物长度为230 bp；Ang1：5′-TTTTGTGTGGGTCTGGT-3′，5′-TTGTTCCCGTCGTAGTTC-3′，产物长度为202 bp；β-actin：5′-CGTTCACATCCGTAAAGACCTC-3′，5′-TCTAATGACGGGACCGAGGAT-3′，产物长度为118 bp.每组细胞取2 μg总RNA，根据说明书逆转录合成cDNA，再取2 μg逆转录产物进行普通PCR，94 ℃ 5 min，95℃ 1 min，58℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，72℃延伸5 min.取反应产物10 μg产物在质量分数为1.5%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后Al-phaView SA软件摄图，并分析eNOS或Ang1与β-ac-tin的相对灰度比值.

（3）免疫组化检测参照本研究小组之前的研究［1］制作免疫组化染色切片，在 400倍镜视野下选取心肌梗死区内10个无重叠视野，利用Nikon NIS-Elements Software BR分析系统计算出平均吸光度，从而对目标蛋白表达含量进行半定量分析.

（4）免疫印迹检测组织匀浆后Bradford法测定蛋白浓度，取其中20 μg蛋白进行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至硝酸纤维素膜上，质量分数为5%的脱脂奶粉封闭2 h后洗膜，标记1∶1 000稀释的eNOS或者Ang1一抗，4℃过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀释）孵育1 h后TBST洗膜，冲洗后暗室曝光显影.同时以β-actin蛋白表达水平作为内参对照.胶片经成像分析系统扫描，并应用AlphaView SA软件分析各样本与β-actin蛋白灰度的相对比值，记录蛋白相对含量.

1.3统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件系统，计量资料以（珋x ±s）表示，组内比较采用配对t检验，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学差异.

2　结果

2.1PKD1对大鼠心肌组织 eNOS和Ang1 mRNA 表达的影响

和模型组比较，PKD1处理组大鼠心肌组织eNOS和Ang1 mRNA表达水平均显著增加（P＜0.01），加入CID755673处理之后，大鼠心肌组织eNOS和Ang1mRNA表达水平均显著降低（P＜0.01），表明PKD1可以明显上调心肌梗死后大鼠心肌组织中eNOS和Ang1的mRNA表达（图1）.

2.2PKD1对大鼠心肌组织中eNOS和Ang1蛋白

表达的影响

免疫组化染色处理后，eNOS或Ang1表达阳性细胞在心肌细胞胞浆内可见黄色或棕黄色颗粒.模型组大鼠心肌组织胞浆中eNOS或Ang1表达阳性的细胞较少；和模型组相比，PKD1处理组心肌组织中呈现大片的胞浆eNOS和Ang1蛋白表达阳性细胞（P＜0.01）；加入CID755673处理之后，大鼠心肌组织中eNOS和Ang1蛋白表达阳性细胞显著减少（P＜0.01）.免疫印迹法检测取得一致的结果，表明PKD1可以显著明显上调心肌梗死后大鼠心肌组织中eNOS和Ang1的蛋白表达（图2、图3）.

图1　PKD1对大鼠心肌组织eNOS和Ang1 mRNA表达的影响Fig.1　Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction

图2　PKD1对大鼠心肌组织中　eNOS和　Ang1蛋白表达的影响（免疫组化法）Fig.2　Effect of PKD1 on protein expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction（immunohistochemistry）.

图3　PKD1对大鼠心肌组织中　eNOS和　Ang1蛋白表达的影响（免疫印迹法）Fig.3　Effect of PKD1 on protein expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction（immu-noblotting）.

3　讨论

本研究证实PKD1可以显著上调心肌梗死后大鼠受损心肌组织中eNOS和Ang1的mRNA及蛋白表达水平.eNOS和其产物NO在血管系统的稳态维持中扮演着重要的角色，不仅调控着血压水平、血管的紧张度，而且发挥着重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效应［8－13］.eNOS的激活是通过1179的丝氨酸激活位点，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通过这一位点而激活eNOS［12－13］.PKD1通过作用于丝氨酸1179激活位点而磷酸化激活eNOS，而且很可能PKD1以一种不依赖Akt的方式参与到VEGF介导的eNOS激活，参与内皮细胞的增殖、迁移和血管新生［14］；采用PKD1阻断剂或者基因沉默PKD1均可以阻断依赖eNOS的动脉内皮细胞的迁移以及受损伤口的愈合［15］.此外，Hsp90也可能通过VEGF参与介导PKD1和eNOS之间的作用［15］.也有学者认为，eNOS属于新发现的PKD的底物，因为eNOS被各种各样氨基酸识别结合激活的位点恰恰均存在于现有报道的PKD底物之内［14－15］.本研究证实的PKD1存在着对eNOS调控作用与上述报导高度吻合.

Ang-l在新生血管系统的塑形、成熟和毛细血管的稳定中起重要作用［16－20］，Ang-l与受体Tie-2结合后，促进血管萌芽和分支，募集内皮周围支持细胞，促进血管重塑和成熟，形成完整的血管壁，并通过调节内皮细胞和血管周围间质细胞的相互作用而维持血管管腔的完整性和稳定性［16－20］.结合报道和本研究结果，推测PKD1可能通过结合eNOS，在VEGF的介导下，进而上调Ang1的表达水平，从而在心肌梗死后受损心肌组织的血管新生中发挥着重要的作用.提示PKD1在心血管系统的功能活动中发挥着十分重要的作用，特别是在调控血管新生进程中内皮细胞的迁移、增殖以及管腔形成作用，可成为心肌梗死等心血管系统疾病治疗的新的靶点.

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［责任编辑：朱颖?］

Regulation of protein kinase D1 on the expression of eNOS and Ang1 in myocardium of rats with myocardial infarction

YANG Lei，MAO Bingyu，LIU Nuan
（Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，China）

Aim：To explore the regulation of protein kinase D1（PKD1）on the expression of endothe-lial nitric oxide synthase（eNOS）and angiopoietin-1（Ang1）in myocardium of the rats with myocardial infarction.Methods：A myocardial infarction model of SD rats was made by ligation of the left anterior descending branch of the coronary artery.At the time of 2 days after the model of myocardial infarction was made，the rats were randomly divided into：model group，PKD1 treatment group，and CID755673 treatment group，with 8 rats in each group.Theeffects of PKD1 and CID755673 on the mRNA expres-sions of eNOS and Ang1 in myocardium of the rats with myocardial infarction were measured by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）.The protein expressions of eNOS and Ang1 were ana-lyzed by immunohistochemical and western blot.Results：Compared with those in the myocardial infarc-tion group，the mRNA and protein expressions of eNOS and Ang1 in myocardial tissue of the rats in the PKD1 treatment group were increased significantly（P＜0.01）.While compared with the PKD1 group，the CID755673group exhibited significant decrease in expressions of mRNA and protein of eNOS and Ang1in the myocardial tissues（P＜0.01），close to the level of the model group.Conclusion：PKD1 significantly upregulated the expression of eNOS and Ang1 in myocardium of the rats with myocardial infarction.

Protein kinase D1；myocardial infarction；endothelial nitric oxide synthase；angio-poietin-1；rat

R322.11；R322.12；R329.2

A

1000－9965（2015）06－0467－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.005

2015－05－19

国家自然科学基金项目（81473438；81202791；81173372），河南省中医内科学重点学科支撑课题项目（豫教高［2012］186号）

杨雷（1977－），男，博士，副教授，研究方向：心血管疾病发病机制研究

毛秉豫（1958－），男，博士，教授，Tel：0377－62071305；E-mail：maobingyu2005＠126.com