SPE-HPLC/QTOF-MS法检测人全血中马钱子碱

刘文龙，孙志卫，李常明，丁 丁，陈文斌

（长沙市公安局刑侦支队，长沙 410004）

SPE-HPLC/QTOF-MS法检测人全血中马钱子碱

刘文龙，孙志卫，李常明，丁 丁，陈文斌

（长沙市公安局刑侦支队，长沙 410004）

目的 建立一种基于固相萃取-高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱检测人全血中马钱子碱的检测方法。方法 样品过Oasis HLB固相萃取小柱，经3 mL去离子水淋洗，有机溶剂洗脱后，在Zorbox Eclipse Plus C18 （2.1mm×50mm，1.8μ m）色谱柱上分离，以0.1%甲酸水溶液-甲醇为流动相梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，四级杆飞行时间串联质谱检测。通过计算500 ng/mL马钱子碱对照样品在上述固相萃取和色谱质谱条件下，不同洗脱溶剂以及不同洗脱体积下的回收效率从而优化洗脱溶剂的种类和使用量。结果 以甲醇为洗脱溶剂，加入量为3 mL时，马钱子碱在200～2000 ng/mL的添加水平下回收率为80.1%～101.3%，相对标准偏差为5.2%～8.3%。人全血中马钱子碱在50～5000 ng/mL范围内线性良好（R2=0.999 97），检测限为10.2 ng/mL，最低定量限为34.1 ng/mL。结论 该方法快速方便，回收率和灵敏度高，可用于人全血中马钱子碱的定量测定。

法医毒物分析；马钱子碱；固相萃取；高效液相色谱/串联四级杆飞行时间质谱

马钱子碱是一种剧毒的白色晶体碱，来自于马钱子和相关植物，临床上用于治疗风湿顽痹等疾病。成人一次摄入马钱子碱60～80 mg即可致死［1］。目前，生物样品中马钱子碱的固相萃取（solid phase extraction，SPE）前处理方法中使用离子交换柱［2］较多，该小柱只对离子和能离子化的物质萃取效率高，但需要对样品进行酸化或碱化处理。而检测方法现有气相色谱质谱法（GC/MS）、高效液相色谱法（HPLC）和高效液相色谱串联质谱法（LC/MS/MS）等［2-4］。本实验通过使用HLB小柱，优化SPE提取条件，建立了一种基于固相萃取-高效液相色谱/串联四级杆飞行时间质谱法（SPE-HPLC/QTOF-MS）检测人血中马钱子碱的新方法。

1 材料与方法

1.1 仪 器

Agilent 1260-6530 Q-TOF LC/MS系统（美国Agilent公司）；Milli-Q 纯水系统（美国Milillipore公司）；Glison GDX-274固相萃取仪（法国Glison公司）。

1.2 色谱条件

色谱柱 Zorbax Eclipse Plus C18（2.1×50 mm， 1.8μm），柱温30℃；进样量1μ L；流动相0.1%甲酸水溶液-甲醇梯度洗脱，洗脱梯度程序见表1；流速0.3 mL/ min；后运行时间7 min。

表1 流动相成分及梯度Table1 Fluid component and gradient of mobile phase

1.3 质谱条件

采用电喷雾离子源（ESI），分析物在正离子扫描模式下检测。Fragmentor电压125 V；毛细管电压3000 V；干燥器温度350℃；干燥气流速9 L/min；喷雾压力35 psi；检测范围100～1200 m/z；扫描速率3 scan/s；双喷雾模式，使用参比溶液实时校正质量轴；4 GHz高精度模式记录质谱数据。母离子和CID碰撞能分别设为395.19653和40 eV，优化参数后的一级提取离子色谱图和二级质谱图，分别见图1和图2。

图1 马钱子碱空白样品加标提取离子色谱图Fig.1 Extraction ion chromatography of brucine in control sample

图2 马钱子碱空白样品加标二级质谱图Fig.2 Q-TOF MS/MS mass spectrum of brucine in control sample

1.4 试剂与耗材

Oasis 固相萃取小柱（HLB 3 cc/200mg，美国Waters公司）；标准品马钱子碱（北京药品生物制品检定所）；甲醇、甲酸、乙腈均为色谱纯；其余试剂为分析纯。

1.5 标准溶液配制

准确称取马钱子碱标准品配制成1.0 mg/mL甲醇储备液，置于4℃冰箱中保存，使用时稀释成相应浓度。

1.6 样品前处理

在空白全血中添加马钱子碱标准品溶液，从中准确吸取1 mL，加1 mL乙腈，然后加入5 mL水稀释，涡旋振荡，8000 r/min 离心10 min，取上清液过柱萃取。HLB小柱依次经1 mL乙腈、1 mL甲醇、3mL去离子水活化、平衡，样品过柱后用3 mL水淋洗，再用3 mL甲醇洗脱，洗脱液混匀后经0.22 μ m微孔滤膜过滤后待检。

1.7 线性关系测定

用空白全血和马钱子碱标准品溶液，配制30、50、100、200、500、2000、5000、10 000、20 000 ng/mL系列浓度的马钱子碱对照样品溶液，按1.6方法进行处理，在选定的色谱和质谱条件下进行分析，分别以马钱子碱峰面积Y对加入标准品量做校正曲线。

1.8 回收率和精密度测定

在空白全血中添加马钱子碱标准品，使马钱子碱的全血浓度分别为200、500、2000 ng/mL，按1.6所述方法进行处理，在选定的色谱和质谱条件下进行分析，以标准曲线计算测定值比实际添加量得回收率，每个浓度样品平行分析3次。

2 结果与讨论

2.1 SPE条件的优化

（1）萃取小柱的选择：HLB由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是一种适合酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。在本实验中不需要调节酸碱性［2］，也能达到较高回收率。故选择HLB作为萃取小柱，样品处理更简单。（2）洗脱液种类的选择：实验方法分别考察了甲醇和乙腈的洗脱效果。通过比较，发现甲醇的洗脱回收率高。故以甲醇为洗脱剂。（3）洗脱剂体积的选择：500 ng/mL马钱子碱对照样品经SPE小柱富集后，分别用1、2、3、4 mL甲醇进行洗脱，洗脱效果见图3。由图可见，随着洗脱液体积的增加，回收率逐渐提高，当洗脱液体积为3 mL时，增加洗脱液体积，回收率基本不变，故本实验选用3 mL甲醇洗脱分析物。

图3 洗脱溶液的体积对目标回收率的影响Fig.3 Effect of eluent volume on the recovery rate of brucine

2.2 标准曲线与线性范围

马钱子碱的全血浓度在50～5000 ng/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为：

y=585.76x+1728.7，R2=0.99997，以信噪比S/N≥3作为检出限，马钱子碱的检测线为10.2 ng/ mL，以S/N≥10作为最低定量限，最低定量限为34.1 ng/mL。

2.3 回收率和精密度

空白全血中加入3种浓度对照品溶液，测得马钱子碱的回收率和精密度见表2。

表2 加标回收率和精密度结果（n=3）Table2 Recovery rate and precision of brucine spiked（n=3）

3 案例应用

2014年7月，我市发生一起利用马钱子投放煎熬中药材进行投毒的案件。用上述检测方法，受害人血液中马钱子碱浓度为31.4 ng/mL，同时检测出士的宁成分。

综上所述，该方法快速方便，所用试剂易得，提取回收率和检测灵敏度高，适用于马钱子碱投毒案件。

［1］ 段韵，姜燕，符芸，等.中药马钱子中毒死亡检验方法的研究［J］.中国药学杂志，2006，41（21）:1616-1618.

［2］ 王朝虹，邢俊波，王志萍. LC/MS/MS法测定全血中马钱子碱和士的宁的含量［J］.中国法医学杂志，2008，23（4）:226-228.

［3］ 王燕军. 气相色谱/质谱检验马钱子碱方法 ［J］.刑事技术，2001（5）:55.

［4］ 白璐，廖林川，颜有仪. 高效液相色谱法检测肝组织中马钱子碱和士的宁［J］.刑事技术，2005（4）:16-19.

引用本文格式：刘文龙， 孙志卫， 李常明， 等.SPE-HPLC/QTOF-MS法检测人全血中马钱子碱 ［J］.刑事技术，2015，40（5）:417-419.

Determination of Brucine in Human Blood by SPE-HPLC/QTOF-MS

LIU Wenlong， SUN Zhiwei， LI Changming， DING Ding， CHEN Wenbin
（Criminal Investigation Detachment of Changsha Public Security Bureau， Changsha 410004， China）

Objective To develop a simple method for determination of brucine in the whole blood based on solid phase extraction （SPE） and high-performance liquid chromatography/electrospray ionization with quadrupole time-of-fl ight tandem mass spectrometry （HPLC/QTOF-MS）.Methods The samples were extracted in HLB column with 3 mL water and organic solvent to be separate as the washing and elution solvent.The extracts were analyzed with Zorbox Eclipse Plus C18 （2.1 mm×50 mm， 1.8 μm） column and gradient elution by mobile phase consisted of water （containing 0.1% formic acid）-methanol at 0.3 mL/min， and the involvement of quadrupole time of flight tandem MS detector.The type and volume of elution were optimized by calculation of recovery effi ciency of 500 ng/mL brucine of the control sample subjected to the different elution solvent and volume.Results Under the optimal condition of 3 mL elution solvent of methanol， the recovery rate of brucine in the blood at 200～2000 ng/mL level was 80.1%～101.3%， and the corresponding standard deviations （ RSDs， n=3）5.2%～8.3%.The calibration curves were linear over 50 ～5000 ng/mL （R2=0.99997）， the limit of detection （LOD） 10.2 ng/ mL， and the limit of quantity （LOQ） 34.1 ng/mL.Conclusions The method is simple， accurate and convenient for qualitative and quantitative determination of brucine in the human whole blood.

forensic toxicology； brucine； solid phase extraction； HPLC/QTOF-MS

DF795.4

B

1008-3650（2015）05-0417-03

10.16467/j.1008-3650.2015.05.016

刘文龙（1987—），男，湖南益阳人，助理工程师，学士，研究方向为理化分析。 E-mail: 84745453@qq.com

2014-12-08