谷氨酰胺对肝硬化患者Treg细胞的影响及其临床意义研究

龚建娥，方云斌，汤维新

0 引言

肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，其致病机制目前仍不清楚，其中涉及多种因素，近年来免疫系统的紊乱逐渐引起了学者们的关注，并成为研究热点［1］。肝硬化门脉高压时胃肠淤血，损伤黏膜屏障，菌群易位，大量内毒素入血，进一步加重炎性介质的释放，破坏机体的免疫防御能力，加重肝脏纤维化［2］，可见肝硬化患者黏膜屏障功能减弱也是引起患者免疫系统紊乱的主要机制之一。CD4+CD25+调节性 T细胞(Regulatory T cell，Treg)是近年发现的一种新型CD4+效应性T细胞亚群，在机体的免疫平衡维持中发挥重要作用［3］。谷氨酰胺(Glutamin)是一种条件必需氨基酸，动物实验显示其可以维持大鼠肠黏膜完整性，抗炎、抗氧化、增强免疫能力［4］。本研究观察谷氨酰胺对肝硬化患者Treg细胞的影响及其肠黏膜保护功能，并探讨其相关的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床病例资料 收集2013年1月至2014年2月我院收治的肝硬化患者62例，肝硬化诊断符合2009美国肝硬化指南。排除标准:心、脑、肺、肾等脏器严重障碍，恶性肿瘤，并发其他免疫、内分泌和结缔组织疾病。62例患者随机分为常规治疗组(对照组)和谷氨酰胺治疗组(观察组)，每组31例。对照组:男18例，女13例，年龄34～72岁，平均年龄(54.7±8.4)岁，病程3～8年，平均病程(5.2±1.4)年，Child-Pugh评分A级9例，B级14例，C级8例;观察组:男19例，女12例，年龄33～71岁，平均年龄(53.2±8.6)岁，病程3～9年，平均病程(5.4±1.6)年，Child-Pugh评分A级8例，B级15例，C级8例。两组患者的性别、年龄、病程、Child-Pugh评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。另取我院健康体检者30例作为正常对照组，其中男16例，女14例，年龄32～71岁，平均年龄(52.8±8.8)岁，正常对照组患者和肝硬化患者在性别、年龄方面比较差异亦无统计学意义(P＞0.05)。

1.2 治疗方法 对照组:进行常规的保肝治疗、营养支持、并发症处理等。观察组:在常规治疗基础上加用谷氨酰胺(广东岭南制药有限公司，国药准字:H20051670)，3次/d，每次餐前30 min服用1小袋。4周为1个疗程，2个疗程后评定效果。

1.3 Treg细胞的流式细胞仪检测 取受试者外周静脉血5 mL，裂解红细胞，1 500 g×20 min，去上清，留取单个核细胞。调整细胞浓度为106/mL，400 μL悬浮液中加入 FITC-CD25和 APCCD4抗体(美国RD公司产品)各10 μL，避光孵育30 min。使用美国B-D公司FACSCalibur流式细胞仪检测CD25和CD4双阳性的Treg细胞。

1.4 白介素-10(IL-10)、二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸表达的检测 IL-10、DAO、D-乳酸表达的检测使用ELISA法，检测试剂盒购自上海伊华临床医学科技公司，严格按照试剂盒说明书操作，对照标准品使用日立HICTHI-7080全自动生化分析仪检测IL-10、DAO、D-乳酸表达水平的改变。

1.5 肝功能的检测 丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)交由检验科，使用全生化分析仪测定。

1.6 统计分析 应用SPSS 12.0统计软件。计量资料以±s表示，数据比较采用t检验，计数资料比较应用 χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 谷氨酰胺对肝硬化患者外周血Treg细胞和IL-10表达的影响 治疗前，两个治疗组的Treg细胞比例、IL-10表达比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但均低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);治疗后，两组的Treg细胞比例和IL-10表达均升高(P＜0.05)，且观察组升高的幅度高于对照组(P＜0.05)，差异均有统计学意义。见表1。

表1 谷氨酰胺对Treg细胞和IL-10表达的影响

2.2 谷氨酰胺对肝硬化患者DAO、D-乳酸表达的影响 见表2。由表2可见，治疗前，两个治疗组的DAO、D-乳酸表达水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但均高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01);治疗后，两组DAO和D-乳酸表达均降低(P＜0.05，P＜0.01)，且观察组降低的幅度高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)。

表2 谷氨酰胺对DAO和D-乳酸表达比较的影响

2.3 谷氨酰胺对肝硬化患者肝功能的影响 见表3。由表3可见，治疗前，两个治疗组的ALT和AST表达比较差异无统计学意义(P＞0.05);治疗后，两组ALT和AST表达均降低(P＜0.05，P＜0.01)，且观察组降低的幅度高于对照组(P＜0.05，P＜0.01)，差异有统计学意义。

表3 谷氨酰胺对肝硬化患者ALT、AST表达的影响

3 讨论

Treg细胞是人体内可抑制炎症反应的CD4+T细胞亚群，IL-10是Tregs细胞分泌的主要免疫抑制效应因子［5-6］。本研究检测结果显示，肝硬化患者Treg细胞比例和IL-10表达均显著低于正常对照人群，说明肝硬化患者处于一种高免疫反应状态，与何文敏等［2］和 Yu 等［7］的报道一致;而经过治疗后Treg细胞比例和IL-10表达显著升高，说明这种高免疫反应状态可以得到纠正。谷氨酰胺是人体细胞能源代谢的一种主要氨基酸，为机体分化和细胞增殖提供重要能量，是重要的抗氧化剂—谷胱甘肽的前体物质，对机体抗氧化、氧自由基的清除和免疫功能调节有积极意义［8］。本研究结果显示，谷氨酰胺治疗组Treg细胞比例和IL-10表达升高的幅度高于对照组，说明其对Treg细胞紊乱的纠正作用较好。

DAO是一种活性较高的细胞内酶，95%以上存在于肠黏膜细胞中，肠黏膜受损、完整性破坏时，DAO释放入血［9］。因此，血液DAO升高可反映肠黏膜损伤。D-乳酸是肠道内固有细菌的代谢产物，肠黏膜完整性破坏、通透性增加时，D-乳酸通过损伤的肠黏膜进入血液［10］。综上，血液DAO和D-乳酸水平的改变可以判断肠黏膜通透性的变化及受损程度。本研究结果显示，肝硬化患者血液DAO和D-乳酸水平均高于正常对照人群，说明肝硬化患者肠屏障的完整性受到破坏，经过积极治疗后，DAO和D-乳酸水平显著降低，说明肠损伤得到了一定的恢复。同时，观察组DAO和D-乳酸降低的幅度高于对照组，说明谷氨酰胺对肠黏膜屏障的保护作用较好。肠黏膜屏障的修复有利于阻止肠道内有害物质和病原体进入机体而进一步损伤肝细胞。观察组ALT和AST表达降低的幅度亦高于对照组，说用常规治疗加上谷氨酰胺有利于肝硬化患者肝功能的恢复。谷氨酰胺在临床使用中的不良反应轻微，仅有个别恶心、便秘、腹泻的报道［11］，本研究中未见上述不良反应的发生，说明谷氨酰胺是一种安全的治疗方法。

综上所述，谷氨酰胺可以升高肝硬化患者Treg细胞比例和IL-10表达，调节机体免疫紊乱状态，有利于肠黏膜损伤的修复和肝功能的恢复，值得临床借鉴采用。

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