回神颗粒含药脑脊液干预PC12损伤细胞凋亡时间窗的实验研究*

★　张玉岭　刘丹　指导：陈宝贵 （天津中医药大学附属武清中医医院　天津301700）

回神颗粒含药脑脊液干预PC12损伤细胞凋亡时间窗的实验研究*

★张玉岭**刘丹指导：陈宝贵 （天津中医药大学附属武清中医医院天津301700）

目的：探讨回神颗粒含药脑脊液体外对缺血缺氧损伤的PC12细胞的保护作用，并探讨其作用的时间窗，为进一步开展临床研究提供依据。方法：采用脑脊液药理学和PC12细胞培养的方法，用回神颗粒含药脑脊液体外培养缺血缺氧损伤的PC12细胞。在PC12细胞损伤后6h、12h、24h、72h，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：PC12细胞模型复制后，神经细胞凋亡在0～72h都有动态变化；回神颗粒含药脑脊液干预的PC12细胞凋亡时间窗0～24h是最佳干预时机，0～72h内仍有意义。结论：回神颗粒含药脑脊液可抑制神经细胞凋亡，其最佳时间窗为0～24 h。

脑脊液；回神颗粒；时间窗；细胞凋亡

创伤性颅脑损伤（TBI）是脑血管病中最严重的一种，其发病率高，病死率高，致残率高，是当今世界上造成死亡和伤残的重要原因，尤其是儿童和年轻人。流行病学资料统计显示，TBI占全身各部位损伤的9%～21%［1-4］。

回神颗粒由全国名中医专家，博士生导师，享受国务院特殊津贴专家，全国第三批名老中医经验继承指导老师，首届中医药传承特别贡献奖获得者，中华中医药学会老年病分会副主任委员陈宝贵教授经过40多年的临床及实验研究研制而成，临床应用于高血压性脑出血急性期、创伤性颅脑损伤等疗效显著，可有效降低致残率，提高生存质量［5］。

回神颗粒主要以鹿角、丹参、菖蒲、灵芝、郁金等药物组成。该药补益五脏精气，兼以化郁、祛痰、消瘀，从而调整五脏功能，达到治疗目的。本实验旨在探讨口服中药回神颗粒在体内代谢后，从细胞凋亡的角度，研究含药脑脊液对体外培养的受损PC12细胞的保护作用，并探讨其作用的时间窗，为进一步开展临床研究提供依据。

1　材料与方法

1.1实验动物大耳家兔，60只，体重（2±0.5）kg，雄性，由军事医学科学院提供。

1.2药品、试剂和仪器中药回神颗粒，由天津武清中医医院提供。多聚赖氨酸 （Sigma），DMEM培养基（Sigma）。PC12细胞为神经生长因子诱导分化型，由本院医学实验科保存。胰蛋白酶（GIBCO）、小牛血清、胎牛血清（杭州四季青公司），噻唑兰（MTT）（Sigma），二甲基亚砜 （DMSO）（上海生工生物工程有限公司），碘化丙啶（PI）染液（Sigma），流式细胞仪（COULTER）。

1.3含药脑脊液制备大耳白家兔6只，空白组和给药组各3只，体重（2±0.5）kg，雄性，适应性喂养3d后给药，给药组按成人剂量折算给药；空白组给服等体积的生理盐水。灌胃后1h，戊巴比妥钠静脉麻醉，于无菌条件下在枕骨大孔处垂直进针，抽取200μL脑脊液，并补充等量生理盐水，以上步骤重复3d，把3d获得的同一家兔的脑脊液混合，-70℃冻存备用。

1.4细胞培养PC12细胞用含10%胎牛血清、青霉素100 kU/L和链霉素100 kU/L的DMEM/F12培养基在玻璃培养瓶中培养，CO2细胞培养箱的培养条件为37℃，5%CO，饱和湿度，待细胞长至80%丰度后用0.25%的胰酶消化传代1次（2～3 d），倒置显微镜观察细胞生长状况，实验时取对数生长期细胞进行实验。进行MTT实验前，将细胞接种到96孔培养板用无血清培养基培养；流式细胞仪检测前，将细胞接种至6孔培养板用无血清培养基培养；免疫组化实验均用24孔培养板爬片法培养细胞，培养基为无血清培养基。

1.5细胞分组当培养的细胞处于对数生长期时，将细胞分为8组：①正常对照组，不加任何处理因素，换同体积新鲜的无血清DMEM/F12培养基；②空白脑脊液组，置换含正常大耳白家兔空白脑脊液的无血清培养液，倾去原培养基，用预热的DPBS漂洗细胞3次，加入无糖无血清的DMEM培养基，置于厌氧培养箱中培养6h；③OGD/R模型组，倾去原培养基，用预热的DPBS漂洗细胞3次，加入无糖无血清的DMEM培养基，置于厌氧培养箱中培养6h。④含药脑脊液组，根据作用时间的不同（6h、12h、24h、48h、72h）分别分为5个小组。造模后，分别加入含药脑脊液继续6h、12h、24h、48h、72h。

1.6MTT法检测PC12细胞存活取对数生长期的PC12细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节细胞密度为1×108/L接种于96孔板中，每孔100μL，无血清培养24 h，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设6复孔［6］。6h、12h、24h、48h、72h后，每孔加入5μg/L 的MTT溶液20μL继续在CO2培养箱中孵育4h，然后取出96孔培养板，弃去上清液，每孔加入150μL 的DMSO，置于摇床上振荡10min，待紫色结晶完全溶解后用酶标仪在490 nm波长处检测各孔的吸光度值 （A490nm）。细胞存活率 （%）=A490 nm（实验）/A490 nm（对照）×100%［8-12］。

1.7流式细胞仪检测细胞凋亡率取对数生长期的PC12细胞，用0.125%胰蛋白酶消化后调节密度为1×108/L接种于96孔板中，每孔2 mL，无血清培养，然后按照上述分组方法进行药物干预，每组设6复孔。24 h后，用细胞凋亡检测试剂盒内的缓冲液300μL重悬，加入5μLAnnexinⅤ-FITC混匀后，再加入5μL PI混匀，室温避光反应10min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率［7］，结果见表1。

表1　不同时点PC12细胞凋亡率的比较　%

2　结果

2.1缺氧环境下PC12细胞形态学观察神经细胞接种后6 h开始贴壁，贴壁细胞以分散或成团形式存在。24 h后细胞伸出粗细不等的突起；72 h后，神经细胞开始呈锥体状、卵圆状或梭形等状态，突起分支细长，光晕明显，大多数细胞折光强，但中心部分较暗。如果不加阿糖胞苷抑制非神经元细胞生长，则在1周时铺满培养瓶，细胞突起互相联接呈网格状、地毯样。如果在72 h加阿糖胞苷干预，则仅有神经元细胞生长。

损伤的PC12细胞逐渐退化，胞体肿胀，出现沉积，神经突起断裂，神经元崩解，坏死的神经元漂浮在培养液上层。随着时间的增加，细胞的损伤逐渐加重。缺血缺氧损伤后，PC12细胞的损伤坏死更加严重。回神颗粒含药脑脊液处理后的PC12细胞，能明显改善糖氧剥夺后细胞形态学改变，表现为减少细胞突起结构的消失，减少细胞碎片的形成。

2.2回神颗粒含药脑脊液对氧糖剥夺/再灌注损伤的PC12细胞模型不同时间点细胞凋亡的影响受损PC12细胞损伤开始6 h，神经细胞开始凋亡，随着损伤时间的延长，细胞的凋亡率也在上升，到24 h达高峰（52.2%）。超过24 h后慢慢下降，72 h仍未恢复至6 h水平。给药组可以明显减少PC12细胞损伤后的凋亡率，推迟凋亡高峰出现的时间，其峰值在48 h出现。说明回神颗粒含药脑脊液可以延迟损伤的PC12细胞的凋亡时间窗。

3　讨论

我们在医疗实践中，充分发掘中医药优势，根据中医辨证理论，在病程早期以中药介入治疗，研究回神颗粒治疗创伤性颅脑损伤的时间窗，最大限度地抢救受损的神经细胞，减轻神经功能缺损程度，已成为一种前沿的治疗趋势。

实验研究表明，损伤的PC12细胞模型在损伤6 h开始凋亡，24 h达到凋亡高峰，48～72 h仍然维持较高的水平。回神颗粒含药脑脊液可以在0～72 h各时间点抑制神经细胞的凋亡，但时间越早，其细胞凋亡率越低，提示干预时机越早，细胞的凋亡损伤越小。研究证明：回神颗粒可以推迟神经细胞凋亡高峰的出现，说明中药回神颗粒有延长神经细

胞凋亡时间窗的作用。本实验结果证明，回神颗粒可能使受到损害的神经元恢复其正常生理功能，最大限度地保留神经功能，且在24 h内进行干预是最佳时机，72 h内治疗可能仍有意义。

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R285.5

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全国名老中医传承工作室建设项目（国中医药人教发［2011］41号）。

**第一作者：张玉岭（1986-），女，博士，医师。研究方向：中医治疗脑病。Tel：15122588780，E-mail：niki19860717@163.com。

（2014-05-07）编辑：万崇毅