Six1在宫颈癌组织中的表达及意义

王彤，朴龙镇，崔雪莲，杨洋，南云泽△

Six1在宫颈癌组织中的表达及意义

王彤1，朴龙镇1，崔雪莲2，杨洋2，南云泽1△

目的探讨Six1基因在宫颈癌组织中的表达情况及其临床意义。方法免疫组织化学SP法检测123例宫颈癌组织，49例宫颈上皮内瘤变（CIN）组织及32例正常宫颈组织中Six1蛋白的表达。体外培养人宫颈癌HeLa细胞，免疫荧光染色观察Six1蛋白在细胞中的定位。结果宫颈癌组织Six1蛋白阳性表达率（72.3%）高于CIN （28.6%）及正常宫颈组织（15.6%），χ2分别为13.118，10.058（均P＜0.01）。不同肿瘤大小，淋巴结及血道转移情况的宫颈癌组织中Six1蛋白阳性表达率差异有统计学意义（均P＜0.01）。Six1蛋白在HeLa细胞中主要定位于细胞浆和核仁。结论Six1与宫颈癌的发生发展密切相关，可能成为宫颈癌的侵袭与转移的分子标志物。

宫颈肿瘤；基因，同源盒；Six1；免疫组织化学；肿瘤浸润；肿瘤转移；HeLa细胞

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，严重威胁妇女的健康。恶性肿瘤的侵袭与转移在不同程度上影响着癌症的进展，其中肿瘤新生血管与逃避免疫系统的识别与破坏有重要意义，转移过程中的“信号转导”已成为肿瘤学领域的研究热点。同源盒基因家族中Six1基因在细胞增殖、分化过程中具有重要的作用，并且在多种恶性肿瘤组织中异常表达［1］。但有关宫颈癌中Six1表达的研究较少，本文旨在通过比较Six1蛋白在不同宫颈组织中的表达情况，探讨其在宫颈癌侵袭转移中的作用。

1　对象与方法

1.1研究对象123例宫颈癌组织芯片购自上海芯超公司，包括107例宫颈鳞癌、16例宫颈腺癌。49例宫颈上皮内瘤变（CIN）组织与32例正常宫颈组织取自延边大学肿瘤研究中心。123例患者年龄34～66岁，中位年龄52岁，＜55岁者64例，≥55岁者59例。肿瘤直径＜3 cm 71例，≥3 cm 52例。依据国际妇产科协会（FIGO）分期标准：早期Ⅰ～ⅡA期76例，晚期ⅡB～Ⅳ期47例。淋巴结转移69例，无淋巴结转移54例。血道转移106例，无血道转移17例。CIN及正常宫颈组织制成石蜡切片并HE染色，已由病理学专家确诊。

1.2细胞及试剂人宫颈癌HeLa细胞购自上海通派生物科技有限公司，常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中。SP免疫组化试剂盒购自丹麦Dako，牛血清白蛋白（BSA）购自北京索莱宝，兔抗人Six1抗体购自Sigma，羊抗兔IgG购自Invitrogen，荧光染料49-6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）及抗荧光淬灭封片液购自碧云天生物技术公司。

1.3方法

1.3.1免疫组织化学检测所有标本釆用SP法进行免疫组化染色。操作步骤参照试剂说明书进行。为保证检测的特异性，分别应用抗兔IgG和PBS代替一抗作为对照。

1.3.2判断标准Six1蛋白阳性染色呈棕黄色颗粒，主要定位于细胞浆和核仁。根据阳性细胞数的比例将染色结果分为3级。0级（阴性）：阳性细胞数为0～5%；1级（阳性）：阳性细胞数为6%～50%；2级（强阳性）：阳性细胞数50%以上。计算1级和2级阳性染色病例占总病例数的百分数。

1.3.3免疫荧光染色取24 mm×24 mm盖玻片，泡酸过夜，纯水洗涤，乙醇浸泡过夜、晾干，放入培养皿。取HeLa细胞接种于培养皿中常规培养。待细胞生长至70%融合时，取出玻片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定10 min，0.5%Triton-X 100破膜10 min，3%BSA室温封闭1 h。PBS冲洗后，兔抗人 Six1抗体（1∶100）4℃孵育过夜，次日用羊抗兔 IgG （1∶1 000）常温孵育1 h，PBS冲洗后DAPI核染细胞。封片液封片后激光共聚焦显微镜观察Six1在细胞中定位。

1.4统计学方法采用SPSS 17.0统计软件处理数据，计数资料以例（%）表示，应用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1免疫组化结果Six1阳性染色主要位于胞浆与核仁，呈棕黄色颗粒，见图1。宫颈癌组织中Six1蛋白阳性表达率为72.3%（89/123），CIN及正常子宫上皮组织中Six1蛋白阳性表达率分别为28.6%（14/ 49）和15.6%（5/32）。宫颈癌组织Six1蛋白阳性表达率高于CIN组织及正常宫颈组织（χ2分别为13.118和10.058，均P＜0.01）。CIN组与正常宫颈组比较，差异无统计学意义（χ2=2.295，P＞0.05）。

2.2宫颈癌组织中Six1的表达与临床病理特征的关系Six1在不同肿瘤大小、淋巴结转移及血道转移情况间表达差异有统计学意义（均P＜0.01），而在不同年龄、肿瘤分化程度以及临床分期间差异无统计学意义，见表1。

Tab.1　Correlations of Six1 protein expression and the clinicopathological features in patients with cervical cancer表1　Six1蛋白在宫颈癌中的表达与临床病理参数之间的关系　例（%）

2.3免疫荧光染色HeLa细胞中Six1蛋白主要定位于细胞浆和核仁，与免疫组化结果相一致，见图2。

3　讨论

Fig.1　Expression of Six1 protein in different cervical tissues（×200）图1　Six1蛋白在不同宫颈组织中表达（×200）

肿瘤的浸润与转移是导致死亡的主要原因，早期发现肿瘤的侵袭与转移倾向将有利于患者的治疗及预后。肿瘤发生的分子生物学基础包括细胞生长与增殖的调控与细胞周期的调控，原癌基因与癌基因及其产物（生长因子，信号转导蛋白与细胞周期调节蛋白等）。同源盒基因是控制机体发育的主要基因，对胚胎器官的发生和细胞分化调控起关键性作用［2］。根据同源盒结构域的差异及基序的不同，将同源盒基因分为Hox、Msx、Pax、Lim、Six等几个家族，其中对Six1的研究较为广泛。Six1定位在染色体14q23，Six1蛋白在胚胎发生发育过程中主要促进细胞增生、组织分化［3］。

Fig.2　Expression of Six1 protein in HeLa cells（×400）图2　Six1蛋白在宫颈癌HeLa细胞中表达（×400）

既往研究表明Six1参与了多种肿瘤的发生发展。Coletta等［4］发现乳腺组织中Six1高表达可导致乳腺细胞恶变、转移。Behbakht等［5］发现卵巢癌中高表达Six1，且Six1表达水平与卵巢癌患者的短期生存率相关。在肝癌和胰腺癌组织中也有类似报道［6-7］。Wan等［8］通过人乳头瘤病毒（HPV）诱导正常宫颈细胞癌变的过程中发现Six1存在过表达，推测Six1是宫颈癌发展的潜在分子标志物。Xu等［9］发现Six1过表达可通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径促进宫颈上皮-间质转化（EMT）。本研究发现宫颈癌组织中Six1蛋白阳性表达率明显高于CIN及正常宫颈组织，提示Six1蛋白可能参与了宫颈癌的发生发展，与Tan［10］的研究结果相一致。Six1蛋白在不同肿瘤大小、淋巴结、血道转移情况的宫颈癌组织中阳性表达率存在差异，提示Six1蛋白的过表达可能与宫颈癌的侵袭与转移相关，但不同临床分期间Six1阳性率差异无统计学意义。免疫荧光染色进一步证实了Six1蛋白在宫颈癌细胞中主要定位于细胞浆和核仁。

Six1蛋白的高表达可能参与了宫颈癌的发生发展过程，有望成为宫颈癌侵袭与转移的分子标志物。本研究的结论与Six1蛋白与其他肿瘤的关系类似，追溯其生物学功能，推测Six1基因通过参与胚胎细胞的发育与分化，调控细胞周期，期间与相应的不同分子或基因共同作用，导致细胞周期的调节异常，进而致其过表达，诱发肿瘤发生。其具体作用机制仍需深入研究与探讨。

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（2014-10-20收稿2014-12-30修回）

（本文编辑胡小宁）

Expression and significance of Six1 in cervical cancer

WANG Tong1，PIAO Longzhen1，CUI Xuelian2，YANG Yang2，NAN Yunze1△
1 Department of Gynecology，Yanbian University Hospital，Yanji 133000，China；2 Department of Pathology，Yanbian University Medical College
△Corresponding AuthorE-mail:yznan@ybu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the clinical significance of protein expression of Six1 in cervical cancer.MethodsThe immunohistochemical（IHC）staining was applied to detect the expression of Six1 protein in normal cervical tissues（n=32），cervical intraepithelial neoplasia（CIN）tissues（n=49）and cervical cancer tissues（n=123）.The localization of Six1 protein was detected in vitro cultured HeLa cells using immunofluorescence（IF）staining.ResultsThe positive rate of Six1was significantly higher in cervical cancer（72.3%）than that of CIN tissues（28.6%）and normal cervical tissues（15.6%，χ2=13.118 and 10.058 respectively，P＜0.01）.There were significance differences in expression levels of Six1 protein between different tumor sizes and metastasis of cervical cancer（P＜0.01）.The Six1 protein showed positive signals in cytoplasm and nucleoli in HeLa cells.ConclusionSix1 expression is associated with cervical cancer，which may be a potential biomarker for invasion and metastasis of cervical cancer.

uterine cervical neoplasms；genes，homeobox；Six1；immunohistochemistry；neoplasm invasiveness；neoplasm metastasis；HeLa cells

R737.33

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.007

国家自然科学基金（61371067）；吉林省科技厅中青年科研创新团队领军人才项目（20130521017JH）

1延边大学附属医院妇科（邮编133000）；2延边大学医学院病理学教研室

王彤（1987），女，医师，硕士，主要从事妇科肿瘤方面研究

△E-mail:yznan@ybu.edu.cn