前列腺素E2缓释微球对成骨样细胞株MC3T3-E1生物学性能的影响

白艳洁， 徐 晖， 张 扬

前列腺素E2缓释微球对成骨样细胞株MC3T3-E1生物学性能的影响

白艳洁， 徐 晖， 张 扬

目的 探讨载前列腺素E2(PGE2)的乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)微球(PGE2- MSs)的药物缓释作用和对成骨样细胞株MC3T3-E1生物学性能的影响。方法 采用膜乳化法制备粒径均匀的PGE2-MSs，用酶联免疫分析法测定微球的载药量和体外药物释放。以无添加物培养基作为空白对照，PGE2和PGE2-MSs(0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)为实验组，与MC3T3-E1细胞株孵育，分别于不同时间用MTT法检测MC3T3-E1细胞株增殖活性、碱性磷酸酶试剂盒检测样本的A值，并用显微镜计数每个视野下的矿化结节数量。结果 实验制备的PGE2-MSs粒径约5 μm，且粒径分布窄；PLGA(IV=0.28)为载体材料的微球载药量为2.5%，48 h药物累积释放量约80%。PGE2-MSs在第2、3、4天的MTT吸光值，第3、5、7天的碱性磷酸酶分泌量，第7、9、11、15天的矿化结节计数与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论PGE2-MSs体外具有明显的缓释PGE2特征，对MC3T3-E1细胞的增殖、分化、成骨作用的影响具有时间和剂量依赖性。

前列腺素E2； 缓释微球； 成骨样细胞； 生物学性能

乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一种生物降解型高分子材料，毒性低，安全性高，生物相容性良好。PLGA是少数取得美国FDA批准的药物载体材料，并已逐步用于临床[1]、组织工程支架[2]和药物载体[3-4]。前列腺素E2(PGE2)是最主要的PGE化合物,活性强，体内含量少，局部合成、释放、灭活，半衰期极短(1～2 min，K Fuller, 1989年)。其主要由成骨细胞合成，直接与破骨细胞和成骨细胞作用,亦可与骨髓细胞间接作用,通过增加破骨细胞和成骨细胞前体细胞的募集介导骨吸收和骨形成作用。在正畸过程中，支抗控制是决定正畸成功的关键。如何利用PGE2低浓度促进成骨的特性增加成骨，以控制支抗，需要缓释PGE2。自2013年5月至2015年2月，我们构建了PLGA微球负载PGE2，通过药物包封率、缓释曲线的实验研究，确定载体的性质，并应用于细胞实验干预MC3T3-E1成骨细胞株。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与材料

pHS-2C型酸度计(上海伟业仪器厂)；S3400扫描电子显微镜)(日本HITACHI公司)；膜乳化器和SPG膜(日本SPG TECHNOLOGY公司)；FDU-2110冷冻干燥机(日本EYELA公司)；CO2培养箱(美国NUAIRE公司)；Tecan Sunrise型酶标仪(奥地利TECAN公司)；乳酸/羟基乙酸共聚物(PLGA50/50，IV=0.28和PLGA50/50 IV=0.67，Absorbable Polymers International，美国)；聚乙烯醇217(上海可乐丽国际贸易有限公司)；乙酸乙酯(天津博迪化工有限公司)；大鼠PGE2酶联免疫分析试剂盒(北京方程生物科技有限公司)；PGE2(武汉三洹医药化工有限公司)；碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALD)试剂盒(日本WAKO公司)；MTT、MEM培养基、胎牛血清、Triton-X100(美国SIGMA公司)等。小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14细胞株(MC3T3-E1 Subclone 14)购自中国科学院上海细胞库(ATCC CRL-2594)，由中国医科大学科学实验中心一部传代保存。

1.2 PGE2-MSs的制备和性质

1.2.1 PGE2-MSs的制备 用膜乳化法制备PLGA微球。称取6 mg PGE2和200 mg PLGA，溶于4 ml乙酸乙酯(油相)；将油相加入30 ml 1%PVA水溶液(水相)中，4000 r/min高速剪切分散1 min，获得初乳；将初乳加入膜乳化器(SPG)中， 7.0～8.0 PSI压力下将初乳完全挤出，获得均匀的乳液，补加1%PVA水溶液30 ml，45 ℃下减压蒸发20 min，除去有机溶剂，获得固化的微球；反复离心-水洗3次，冷冻干燥；干燥微球喷金后，用扫描电子显微镜观察。ELISA法测定PGE2的载药量(DL，wt%)

1.2.2 PGE2-MSs的体外药物释放度 参照文献[5]用乙醇-PBS pH 7.4溶液(V乙醇：VPBS=1∶1)作为释放介质，“直接释药法”考察微球的体外药物释放。精密称取PGE2-MSs 2 mg，置5 ml离心管中，加入4 ml释放介质，置(37±0.5)℃恒温水浴摇床中，100 r/min振荡，分别于3、6、9、12、24、48 h取释放介质3 ml，立即补加3 ml释放介质。样品8000 r/min离心5 min，取上清液测定PGE2含量。采用大鼠PGE2酶联免疫分析试剂盒测定PGE2含量，检测范围为20～400 ng/ml。

1.3 PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株生物性能的影响

1.3.1 成骨细胞株MC3T3-E1的培养 将小鼠MC3T3-E1细胞按3×105/ml培养于含有100 ml细胞标准培养液，对数生长期时传代，之后冻存、复苏，再接种于细胞培养瓶并置于CO2孵箱内培养。

1.3.2 PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株增值的影响

将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA消化收集后，加入10%FBS的MEM培养液制成2×104/ml细胞悬液加于96孔微量培养板中，每孔0.1 ml，待细胞铺满孔底后，分别取不同浓度(0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)PGE2、空白微球和PGE2- MSs加于96孔培养板中，标准条件下培养。分别于24、48、72 h后取出，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4 h；待有明显的紫色甲臜颗粒出现时，充分吸除上清液，每孔加DMSO 100 ml终止反应，将培养板放在平板摇床上振荡10 min；待紫色甲臜颗粒充分溶解后，以空白孔调零，用酶标仪在A570波长处分别测定其OD值。

1.3.3 PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株分泌ALP的影响 细胞培养同上，分别于3、5、7 d后取出，吸去旧的培养液，用无菌PBS液反复冲洗贴壁3次并加入胰蛋白酶消化后，再次加入MEM终止消化；吸入离心管中，放入离心机，以1000 r/min离心5 min，弃上清液，每管加入200 μl 2%的Trition-100,4 ℃冰箱裂解细胞12 h并反复吹打数次后，以1000 r/min离心10 min。每孔取5 μl上清液，按照ALP试剂盒的要求操作，于520 nm波长的紫外分光光度计下测定A值。

1.3.4 PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株基质矿化程度的影响 将处于对数生长期的MC3T3-E1细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化收集后，加入10%FBS的MEM培养液制成2×105/ml细胞悬液加于24孔培养板；每孔1 ml,待细胞铺满孔底后，分别取用OriCellTM小鼠成骨诱导培养液稀释的不同浓度(同前)PGE2、PGE2-MSs和空白微球加于24孔培养板中，在标准条件下培养诱导钙化。每2 d换液1/2。分别于第7、 9、 11、 13天取出，用95%乙醇原位固定10 min,0.1%茜素红染色(ARs)30 min,流水冲洗10 min。低倍(×20)光镜下观察并摄影,每孔随机取4个视野, 采用双盲法计数每个视野下的矿化结节数量，计算每孔 4个视野计数之和。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 PGE2-MSs的制备和性质

PGE2-MSs的粒径和载药量测定结果见表1，扫描电镜照片见图1。PGE2-MSs呈规则球形，表面光滑，采用膜乳化技术制备的微球，平均粒径约为5 μm，且粒径分布窄。PGE2-MSs显示出明显的体外药物缓释作用，但以高分子量PLGA(IV=0.67)为载体材料的微球，在经过初期的突释阶段后，药物释放量不再增加。以低分子量PLGA(IV=0.28)为载体材料的微球，具有持续的药物缓释效果(图2)，48 h药物累积释放量接近80%。从治疗的角度考虑，后者的释放效果更理想。

表1 PGE2-MSs的粒径和载药量

2.2 PGE2-MSs对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1生物性能的影响

2.2.1 PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株增殖的影响与对照组(0浓度PGE2-MSs、空白对照)相比，0.0125、0.05 μmol/L PGE2-MSs，对MC3T3-E1细胞增殖具有促进作用(P<0.05)；而浓度为0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L的PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞增殖具有抑制作用(P<0.05)，且呈剂量依赖性；PGE2-MSs的促进作用大于等浓度PGE2，抑制作用低于等浓度PGE2，差异有统计学意义(P<0.05)。而在48、72h，则与相同浓度的PGE2的促进或抑制作用无显著性差异。

2.2.2PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞株分泌ALP的影响 各种浓度的PGE2、PGE2-MSs在3个时间点均对MC3T3-E1细胞分泌ALP具有促进作用(P<0.05)，且具有剂量依赖性(除外0.0125μmol/L浓度的PGE2-MSs在3d时对MC3T3-E1细胞分泌ALP无影响)。等浓度两组比较，第3天时，PGE2的促进作用大于PGE2-MSs(P<0.05)；第5天时，对ALP的分泌影响达到高峰，但差异无统计学意义。第7天时，ALP分泌开始下降，但PGE2-MSs促进作用大于等浓度PGE2，差异有统计学意义(P<0.05)，并出现随时间延长而差异增大趋势。

2.2.3PGE2-MSs对小鼠成骨样细胞株MC3T3-E1基质矿化程度的影响 不同浓度的PGE2-MSs(0.0125、0.2、0.8、3.2、12.8μmol/L)在第7天时，对MC3T3-E1细胞基质矿化的促进作用低于相同浓度的PGE2(P<0.05)，而第9天时，则略高于相同浓度的PGE2，差异具有统计学意义(P<0.05)，而第11、15天时对MC3T3-E1细胞基质矿化的促进作用高于相同浓度的PGE2(P<0.05)。提示各种浓度的PGE2-MSs对MC3T3-E1细胞基质矿化具有促进作用，且具有剂量依赖性。见图3。

3 讨论

目前,大部分PLGA微球均采用乳化分散法和相分离凝聚法制备。其中相分离法适合于水溶性药物微球的制备，乳化分散法对水溶性、脂溶性药物均适宜。溶剂挥发法是乳化分散法中常用的制备方法之一[6]。但对水溶性药物往往包封率低[7]。本实验由于PGE2为非水溶性药物的理化性质，所以采用膜乳化法制备PLGA微球，能获得理想的载药率和包封率，且所制得微球的粒径均匀。

微球中药物的释放有2种机制[8]：⑴扩散机制。药物由进入微球的溶液溶解后经微球的孔隙扩散到介质中，微球表面药物的溶解及扩散可形成释药的突释效应。⑵降解机制。聚合物降解成为体内的代谢产物，可使药物释放。本实验释药结果表明：PGE2/PLGA微球中的PGE2释放符合双相动力学释药规律，即初相为快速释药相，后相为缓释相。这种释药特点可以使局部形成有效浓度并维持下去，本实验48 h体外释药率接近80%。本实验观察了PGE2-MSs的缓释作用，由于具体时间的缓释浓度累积及代谢量无法精确控制，故设计缓释微球的终释放量等于PGE2组的起始浓度，即PGE2-MSs组起始浓度低于PGE2组。在观察增殖实验24 h时，将PGE2组与PGE2-MSs组等浓度比较OD值有显著性差异，PGE2组增殖作用强于PGE2-MSs组；48、72 h二者达到相近的增殖状态；在观察细胞分化实验3 d，PGE2组与PGE2-MSs组等浓度比较，A值均具有统计学意义，PGE2组分化作用强于PGE2-MSs组，5 d后，二者达到相近的分化状态，而第7天时，PGE2-MSs组促进成骨细胞分化的作用强于PGE2组；在观察矿化实验7 d，PGE2组促进成骨细胞矿化的作用强于PGE2-MSs组，第9天浓度为 0.0125、0.05μmol时PGE2组促进矿化作用强于PGE2-MSs组，而第11天时结果出现逆转，0.8、3.2、12.8 μmol/L浓度时PGE2-MSs组促进成骨细胞矿化的作用强于PGE2组；15 d且浓度为0.05、0.2、0.8、3.2 μmol/L时，PGE2-MSs促进成骨细胞矿化的作用明显强于PGE2。以上结果清晰地展现了PGE2-MSs载体随时间变化呈现作用增强的趋势。因此我们推测，PGE2-MSs在细胞实验中具有缓释作用，影响成骨细胞增殖、分化、矿化。二者在0.0125、12.8 μmol/L浓度，第15天时对矿化影响接近一致，提示本实验PGE2-MSs的最长缓释时间为15 d。关于PLGA为载体材料的PGE2-MSs的研究，国外仅有少量报道[9]，PGE2作为组织工程研究的靶分子，通过载体可以改变其半衰期。因此，PLGA-PGE2作为组织工程的优良药物释放系统，必将吸引更多学者的关注。

图1 PGE2-MSs的扫描电子显微镜照片 a. 空白微球 b. PLGA50/50，IV=0.28 c. PLGA50/50，IV=0.67 图2 PGE2-MSs的体外药物释放曲线 图3 PGE2-MSs对成骨细胞基质矿化的影响 a.7 d b.9 d c.11 d d.15 d
Fig 1 Electron micrograph of PGE2-MSs. a. blank microspheres. b. PLGA50/50, IV=0.28. c. PLGA50/50, IV=0.67. Fig 2 drug release profiles of PGE2-MSs in vitro. Fig 3 Effect of PGE2-MSs on osteoblast mineralization a. 7days b. 9 days c. 11 days d. 15 days

[1] Lagarce F, Cruaud O, Deuschel C. Oxaliplatin loaded PLAGA microspheres: design of specific release profiles[J]. Int J Pharm, 2002,242(1-2):243-246.

[2] Jackson JK, Hung T, Letchford K, et al. The characterization of paclitaxel-loaded microspheres manufactured from blends of poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) and low molecular weight diblock copolymers[J]. Int J Pharm, 2007,342(1-2):6-17.

[3] Gupte A, Ciftci K. Formulation and characterization of Paclitaxel, 5-FU and Paclitaxel+5-FU microspheres[J]. Int J Pharm, 2004,276(1-2):93-106.

[4] Liggins RT, Burt HM. Paclitaxel-loaded poly(l-lactic acid) microspheres 3: blending low and high molecular weight polymers to control morphology and drug release[J]. Int J Pharm, 2004,282(1-2):61-71.

[5] Roberto Nicolete R, Lima Kde M, Júnior JM, et al. Prostaglandin E(2)-loaded microspheres as strategy to inhibit phagocytosis and modulate inflammatory mediators release[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2008,70(3):784-790.

[6] Park S J , Kim SH. Preparation and characterization of biodegradable poly (l-lactide)/poly ( ethylene glycol) micro-capsules containing erythromycin by emulsion solvent evaporation technique[J]. J Colloid Interface Sci , 2004,271(2):336-341.

[7] Gang R, Si SF. Preparation and characterization of poly(lactic acid)-poly (ethyleneglycol)-poly (lactic acid) (PLA2PEG2PLA) microspheres for controlled release of paclitaxel[J]. Biomaterials, 2003,24(27):5037-5044.

[8] Uludage H, Gao T, Porter TJ, et al. Delivory systems for BMPs: factors contributing to protein retention at an application site[J]. J bone joint Surg Am, 2001,83-A Suppl 1(Pt 2):S128-S135.

[9] Watzer B, Zehbe R, Halstenberg S, et al. Stability of prostaglandin E2 (PGE2) embedded in poly-d, l-lactide-co-glycolide microspheres: a pre-conditioning approach for tissue engineering applications[J]. J Mater Sci Mater Med, 2009,20 (6):1357-1365.

Effect of sustained release microspheres from prostaglandin E2 on the biologic properties of osteoblast-like cell line MC3T3-E1

BAIYan-jie,XUHui,ZHANGYang.

(DepartmentofOrthodontics,DentalHospitalofChinaMedicalUniversity,Shenyang110002,China)

Objective To investigate the drug release of prostaglandin E2 (PGE2)loaded on lactic acid-glycolic acid copolymer (PLGA) microspheres (PGE2-MSs) and the drug effects on the biological properties of osteoblast-like cell line MC3T3. Methods PGE2-MSs in uniform size were prepared by using membrane emulsification, the entrapment efficiency of the microspheres and drug release in vitro were detected by enzyme-linked immunosorbent assay method; The experimental groups were added in the medium with PGE2-MSs at different concentrations (0.0125、0.05、0.2、0.8、3.2、12.8 μmol/L)and the blank control was added without any additives. All were incubated with MC3T3-E1 cell line. The proliferative activity of MC3T3-E1 cell line was detected by MTT assay at different times and the A valuation was measured by alkaline phosphatase kit, and then the number of mineralized nodules in each perspective were counted under a microscope. Results The prepared PGE2 MSs was in about 5 μm size with narrow particle size distribution; the entrapment efficiency of the microsphere prepared from PLGA (IV=0.28) was 2.5%, cumulative emissions at 48 h were about 80%; MTT absorbance value at 2, 3 and 4 days, the secretion levels of alkaline phosphatase at 3,5 and 7 days, the number of mineralized nodule at 7, 9, 11 and 15 days were significantly different compared with the control groups (P<0.05). Conclusion PGE2-MSs possess obviously the characteristic of sustained release of PGE2 in vitro, and have a influence on proliferation, differentiation and ossification of MC3T3-E1 by the time and dose-dependent manner.

Prostaglandin E2; Sustained release microspheres; Osteoblast-like cell; Biological properties

110002 辽宁 沈阳，中国医科大学附属口腔医院 正畸科(现辽宁省人民医院 口腔科：白艳洁)；沈阳药科大学药学院 药剂系(徐 晖)；中国医科大学附属口腔医院 正畸科(张 扬)

白艳洁(1967-)，女，辽宁沈阳人，主任医师，博士研究生.

张 扬，110002，中国医科大学附属口腔医院 正畸科，电子信箱：yz1958cmu@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.015

R

A

1673-7040(2015)04-0235-04

2015-03-06)