葛根芩连汤对高脂饲料饲喂的大鼠非酒精性脂肪性肝炎的实验研究

宋红梅 曲 岩 李绍民▲ 陈景华 张 宁

1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002；2.黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江佳木斯154007

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种与代谢相关的应激性肝损伤，主要特征是甘油三酯（TG）蓄积，包括单纯性脂肪肝（NAFL）、脂肪性肝炎（NASH）和肝硬化（NAFC）。研究表明，NAFLD已成为无症状性转氨酶升高的首要原因[1-3]，同时又是肥胖、胰岛素抵抗、高脂血症等代谢综合征相关组分在肝脏的集中体现，严重威胁着人民的身体健康。从NAFL到NAFC的过程中，NASH起着限速的作用，是形成肝硬化的重要原因之一[4-5]。目前研究证实，中医药对NASH的防治具有全方位、多靶点的立体作用，还能针对发病的脂代谢紊乱、胰岛素抵抗[6-7]、氧化应激和脂质过氧化损伤等多个环节的效应指标进行有效调节。现代研究表明，葛根芩连汤具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。所以本实验选用葛根芩连汤干预高脂饲料诱导的NASH大鼠模型[8]，为开发防治NASH有效的中药制剂提供新思路和实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周雄性SD大鼠40只，体重约为（150±200）g，由佳木斯大学动物实验中心提供。

1.1.2 实验中药 处方饮片均购自北京同仁堂制药集团哈尔滨药店，依《伤寒论》生药比例为葛根∶黄连∶黄芩∶炙甘草=8∶3∶3∶2，以该剂量作为低剂量，2倍该剂量为高剂量。用药剂量按实验动物与60kg成人体表面积比等效量核算比率，计算动物的等效剂量。实验时以去纯化水配制成所需浓度，放冰箱保存。

1.1.3 实验饲料 基础饲料及高脂饲料（北京科澳协力饲料有限公司）。

1.1.4 试剂 AST、ALT、TC、TG、HDL-C、LDL-C的全自动生化分析试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；IL-6、IL-10、TNF-α酶联免疫试剂盒（上海信裕生物科技有限公司）。

1.1.5 主要仪器 7160全自动生化仪（日本日立公司），美国MULTISKAN MK3全自动酶标仪（Thermo），CH-6010组织匀浆机（KINEMATTICA）。其他设备及器具包括：手术器械、离心管、移液管、吸管、试管、烧杯等。

1.2 方法

1.2.1 模型的建立 以高脂饲料连续饲喂8周[9]，自由饮水、摄食，建立NASH大鼠模型。

1.2.2 分组及处置 全部SD大鼠饲喂基础饲料1周后，随机分为4组，每组10只，分别为空白组、模型组、葛根芩连汤低剂量组、葛根芩连汤高剂量组。空白组给予普通饲料，模型组和给药组给予高脂饲料。给药组在饲喂高脂词料的同时分别给予10mL/kg鼠重相应浓度中药灌胃；模型组和空白组按鼠重灌服纯化水。每天固定时间进行一次灌胃，每个组的造模和灌胃同行进行，实施8周结束。

1.2.3 标本采集 实验8周结束全部大鼠取材，取大鼠腹主动脉血及肝组织用于血清学和肝组织相关指标检测。

1.2.4 血清学指标 全自动生化分析仪进行测定血清的相关指标：ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C。酶联免疫法测定血清IL-6、IL-10、TNF-α。

1.2.5 肝组织匀浆上清指标 肝脏IL-6、IL-10、TNF-α水平。在冰水浴中，取肝组织利用超声匀浆机制成匀浆，静置一会，离心后取上清液，按试剂盒说明进行检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS19.0软件，计量资料以（）表示，对实验结果进行单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏酶学

在血清ALT、AST水平检测，模型组显著高于空白组（P＜0.01），葛根芩连汤高、低剂量组显著降低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组血清ALT、AST比较（± s，U/L）

表1 各组血清ALT、AST比较（± s，U/L）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n ALT AST空白组 10 296.75±3.59 18.59±2.23模型组 10 421.95±12.64** 35.68±3.15**葛根芩连汤低剂量组 10 290.15±15.69## 27.68±4.39##葛根芩连汤高剂量组 10 208.36±16.98## 24.59±4.29#

2.2 血脂

与空白组比较，模型组血清HDL-C水平显著降低，血清LDL-C、TG、TC含量明显增加，差异均具有统计学意义（P＜0.01）。葛根芩连汤高、低剂量组血清HDL-C水平与模型组相比增加，血清TG、TC、LDL-C水平下降明显，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比较（± s，mmol/L）

表2 各组血清HDL-C、LDL-C、TG、TC比较（± s，mmol/L）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

?

表3 各组血清IL-6、IL-10、TNF-α 比较（± s）

表3 各组血清IL-6、IL-10、TNF-α 比较（± s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n IL-6 IL-10 TNF-α空白组 10 24.63±5.16 190.58±15.21 85.39±30.25模型组 10 130.51±12.68** 36.95±10.12** 228.39±20.03**葛根芩连汤低剂量组 10 165.39±10.11## 110.80±10.06## 80.61±10.04##葛根芩连汤高剂量组 10 61.92±15.08## 240.96±30.11# 100.65±20.09##

表4 各组肝组织IL-6、IL-10、TNF-α 比较（± s）

表4 各组肝组织IL-6、IL-10、TNF-α 比较（± s）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别 n IL-6 IL-10 TNF-α空白组 10 144.63±11.16 253.58±11.21 455.39±10.25模型组 10 180.51±11.68** 216.95±12.12** 608.39±40.03**葛根芩连汤低剂量组 10 65.39±10.51## 250.80±12.06## 530.61±18.04##葛根芩连汤高剂量组 10 68.92±5.08# 246.96±15.11## 530.65±40.09##

2.3 血清IL-6、IL-10、TNF-α测定

与空白组比较，模型组血清IL-10显著降低，血清IL-6、TNF-α明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，葛根芩连汤高、低剂量组在增加血清IL-10、降低血清IL-6、TNF-α方面差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 肝组织匀浆IL-6、IL-10、TNF-α测定

与空白组相比，模型组肝组织匀浆IL-6、TNF-α水平升高，IL-10水平降低，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；葛根芩连汤高、低剂量组与模型组相比，对肝组织匀浆IL-6、IL-10、TNF-α的改善，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

3 讨论

虽然现代医学对NASH的发病机制及治疗已经进行了大量研究，但由于该病发病的复杂机制及西药作用的单一性使研究受到阻碍，而葛根芩连汤治疗NASH方面鲜有报道。本实验采用高脂饮食诱导的大鼠NASH模型[10-11]，该模型的建立符合人类NASH常见的发病因素，与人类NASH的发病机制也基本相似，能出现以胰岛素抵抗、代谢综合征等为特征的全身代谢紊乱表现，肝脏组织病变具有进行性发展的特点。根据配方的不同，多数可以在4～8周内形成病变程度逐渐加重的NASH模型[12]。现代研究发现，葛根芩连汤可用于治疗2型糖尿病湿热内蕴证，馈荡性结肠炎等疾病[13-15]，具有改善血糖，抗炎，抗氧化的作用。因此，本实验遵循中医学“异病同治”的原则[16]选用葛根芩连汤进行防治NASH的探索性研究。本实验结果显示，在肝细胞损害方面，造模8周后，大鼠模型血清ALT、AST水平显著升高，葛根芩连汤同时干预的各组，血清ALT、AST水平较模型组明显降低，提示葛根芩连汤高、低剂量组同时干预对防治NASH转氨酶升高方面有积极作用；在血脂代谢方面，造模8周后，大鼠模型血清LDL-C、TG、TC含量显著升高，HDL-C显著降低，葛根芩汤同时干预的各组中，葛根芩连汤高、低剂量组血清HDL-C水平与模型组相比明显增加，血清TG、TC、LDL-C水平明显下降，提示葛根芩连汤基本可以达到对NASH脂代谢异常的改善作用[17-19]；在血清及肝组织炎性因子方面，造模8周后，大鼠模型血清及肝组织IL-6、TNF-α含量显著升高，IL-10显著降低。与模型组相比，葛根芩连汤同时干预的各组中，葛根芩连汤高、低剂量组在增加IL-10、降低IL-6、TNF-α方面均差异显著。提示葛根芩连汤在改善炎性因子方面，不仅对NASH引起的肝脏局部炎症有影响，同时能够改善全身血清炎症因子水平，并从抑制促炎因子，提高抑炎因子两方面动态调控炎症的发展。虽然中医药防治NASH的实验研究为临床用药及新药开发提供了更多的实验数据，可以看到中医药多靶点调控疾病发生发展的优势，特别是在调节脂代谢、干细胞损伤、炎症等方面效果显著。然而，其中仍然存在一些问题：目前实验研究所用的动物模型虽然力求在病因、发病机制、组织病理学表现上与人类接近，但仍不能完全符合中医传统的证候学特点，对于中医药的实验研究，仍缺乏病证结合的理想模型，极大影响了中医药防治NASH的研究进展。而且对于实验研究结果缺少细致地思考与分析，普遍停留在重复性认识上，研究结果回归临床的价值少有体现。所以今后的研究应尽可能紧密联系临床实际，对研究结果进行深入地思考分析，必要时可进行重复实验以验证研究结果的可靠性，从而为临床治疗提供科学的实验依据。

[1]Farrell GC，Larter CZ.Nonalcoholic fatty liver disease：from steatosis to cirrhosis[J].Hepatology，2006，43（Suppl1）：S99-S112.

[2]de Alwis NM，Day CP.Non-alcoholic fatty liver disease：themist gradually clears[J].J Hepatol，2008，48（Suppl 1）：S104-S112.

[3]Angulo P.GI epidemiology：nonalcoholic fatty liver disease [J].Aliment Pharmacol Ther，2007，25（3）：883-889.

[4]Powell EE，Cooksley WG，Hanson R，et al.The natural history of nonalcoholic steatohepatitis：a follow-up study of forty-two patients for up to 21 years[J].Hepatology，1990，11（1）：74-80.

[5]Caldwell SH Crespo DM.The spectrum expanded：cryptogenic cirrhosis and the natural history of nonalcoholic fatty liver disease[J].Journal of Hepatology，2004，40（4）：578-584.

[6]Nair S，DiehlAM，W isemanM，et a1.Metformin in the treatment of nonalcoholic steatohepatitis：A p ilot open label trial[J].Aliment Pharmacol Ther，2004，20（2）：2.

[7]Uygun A，Kadayifci A，Isik AT，et al.Metformin in the treatment of patients with nonalcoholic steatohepatitis[J].Aliment Pharmacol Ther，2004，19（3）：537.

[8]艾正琳，陈东风.SREBP-Ic在大鼠非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义[J].第三军医大学学报，2006，28（10）：1063-1065.

[9]王允亮，诸葛丽，李军祥，等.调肝化独解毒方对NASH大鼠的治疗作用及其机理研究[J].江苏中医药，2012，44（5）：71-73.

[10]钟岚.非酒精性脂肪肝动物模型[J].国外医学消化疾病分册，1999，19（3）：175-178.

[11]London RM，George J.Pathogenesis of NASH：animal models[J].Clin Liver Dis，2007，11（4）：55-74.

[12]楼琦，石巧娟，郭红刚，等.非酒精性脂肪肝大鼠脂质代谢及病理变化的动态观察[J].中国比较医学杂志，2012，22（3）：5-11.

[13]Tong XL，Zhao LH，Lian FM，et al.Clinical observations on the dose-effect relationship of Gegen Qin Lian Decoction on 54 out-patients with type 2 diabetes[J].Journal of Traditional Chinese Medicine，2011，31（1）：56-59.

[14]赵林华，姬航宇，全小林，等.葛根零连汤治疗糖尿病理论探讨 [J].中华中医药杂志，2012，27（2）：280-283.

[15]王浩，徐明，王思程.葛根等连汤对馈癌性结肠炎模型大鼠血清Bcl-2、TGF-β1的影响[J].四川中医，2011，29（11）：12-14.

[16]李军祥，陈润花，苏冬梅，等.中医药治疗非酒精性脂肪性肝病研究述评[J].世界华人消化杂志，2010，18（14）：1443-1451.

[17]Jump BD，Botolin D，Wang Y，et al.Fatty acid regulation of hepatic genetranscription [J].Nutr，2005，135（11）：2503.

[18]Yu P0，Yin D，Kris PM，et al.Long-chain polyunsaturated fatty acids upregulate LDL receptor protein expression in fib- reblasts and HepG2 Cells[J].Nutr，2005，135（11）：2541-2545.

[19]Coleman RA，Lee DP.Enzymes of triacylglycerol synthesis and their regulation[J].Prog Lipid Res，2004，43（2）：134-176.