β—PGG及没食子酸在不同pH条件下含量分析

郑仕萍 周国丽 杨晓红 郭雪 范源

摘要：目的研究并分析1，2，3，4，6-五-0-没食子酰-β-D-葡萄糖（p-PGG）在不同pH磷酸盐缓冲液中的含量变化情况。方法：采用经典恒温法考察p - PGG在不同pH缓冲液（pH分别为2.3、4、5.6）中的水解情况，用反相高效液相色谱测定B- PGG及其水解产物含量并进行分析。结果β- PGC随着pH值的上升其含量呈现下降的趋势，pH为5时含量最低，没食子酸的含量呈现上升的趋势。结论 β-PGG及没食子酸在不同的pH条件下含量的变化提示反映了酸碱度对B- PGG水解反应的影响，对该现象的研究可为中药的养护、储存及加工等实际应用提供一定参考。

关键词：1，2，3，4，6-五-0-没食子酰-p-D-葡萄糖（β-PGC）没食子酸；pH缓冲液；水解反应

中图分类号：R284

文献标志码：A

文章编号：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0064 - 021，2，3，4，6-五-0-没食子酰-p -D-葡萄糖（β-PGC）属于水解类鞣质，是葡萄糖与5个没食子酸形成的酯。五倍子、余甘子、牡丹皮、赤芍、白芍等自然界的一些植物中均含有β- PGG，且在五倍子、牡丹皮、赤芍、白芍中β- PGG含量较高[1]。其对称的化学结构使其除了具有螯合金属离子，沉淀蛋白质，淬灭活性氧等一般多酚类物质的共同特点外，在以往的研究中还发现β- PGC在抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗感染、胰岛素样作用等方面有广泛的应用前景，而对其在不同pH下的变化研究较少[2]。因此本实验根据β-PGG的化学性质及没食子酸的稳定性，考察β-PGG在不同pH溶液中水解产生没食子酸后其含量的变化情况。1 实验材料与色谱条件1.1 仪器与试药 Agilent - 1200型高效液相色谱仪；分析天平；酸度计；水浴锅。1，2，3，4，6-五-0-没食子酰-β-D一葡萄糖对照品（购于四川成都普瑞法有限公司）；没食子酸对照品（购于昆明中检所）；甲醇和乙腈均为色谱纯，其余试剂为分析纯；纯净水；磷酸盐缓冲液（A液：磷酸0. 83 mL加水至50 mL，B液：磷酸氢二钠7.2g，加水溶解成100 mL；取A、B不同体积配成pH为1.7的缓冲液，再用纯净水将其稀释成pH为2、3、4、5、6的缓冲液）。1.2 色谱条件 没食子酸色谱条件：色谱柱ZoRBAX SB -C18柱（4.6×250 mm，5 um），流动相：甲醇和0.2%磷酸（5：95）；柱温：25℃；检测波长：273 nm；流速：lmL/min；进样量：20ul。β- PGG色谱条件：色谱柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x250 mm，5 um）；柱温：25℃；检测波长：280 nm；流速：l mL/min；进样量：20 uL；乙腈和0.1%磷酸为流动相梯度洗脱，其洗脱条件见下表。2实验方法2.1 标准曲线的制备 β- PGG标准曲线的制备精密称取对照品8 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，摇匀作为储备液。从中精密吸取10 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述β- PGC色谱条件分别取2、4、6、8、10、15 uL不同体积进样，以β- PGG的峰面积（Y）对其标准品的质量（x）进行线性回归，得方程y=2420237x -18. 445.r=0.9998，结果表明：β- PGG峰面积值与质量有良好的线性关系，线性范围为0. 139～1.0428 ug。没食子酸标准曲线的制备精密称取对照品2.5 mg置于25mL容量瓶中，用50010的甲醇溶解定容至刻度，摇匀作为储备液。分别精密吸取0.1、0.5、1、2、4mL于10mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即配制成浓度为1、5、10、20、40 ug/n1L的标准溶液。按上述色谱条件进样20uL，以没食子酸的峰而积（Y）对其标准品浓度（x）进线性回归，得方程y=1 14. 7x+2.4554，r=0.9999，结果表明：没食子酸峰面积值与浓度有良好的线性关系，线性范围为l～ 10ug/mL。2.2实验内容2.2.1 实验原理没食子酸与葡萄糖酯化反应产生的β-没食子酰葡萄糖是合成PGG的第一个酶催化反应活性底物，葡萄糖上的羟基进一步与没食子酸呈现一种有规律的结合方式[4]。结合顺序为：1，6-二-O-没食子酰葡萄糖一l，2，6-三-O-没食子酰葡萄糖一l，2，3，6-四-O-没食子酰葡萄糖一1，2，3，4，6-五-O-没食子酰葡萄糖。没食子酸结合在葡萄糖上是以酯键形式结合的，酯键可以在酸、碱条件下水解，凶此可以根据酯键的性质水解β-PGG。水解顺序与结合顺序相反。没食子酸为弱酸性物质，在强氧化条件下没食子酸降解迅速且不稳定，当pH值为7.O- 10.0时，没食子酸在3h内已完全降解，说明在碱性和中性条件下没食子酸极不稳定，而其在强酸、强光、高温的条件下较稳定[4]。据文献显示，没食子酸在pH为2.0-6.0范围内比较稳定[5]。没食子酸降在含盐酸的高温液态水中的降解过程[6]：3，4，5-三羟基苯甲酸-3，4，5-三羟基苯酚（焦性没食子酸）-3-羟基邻苯醌一红桔酚（2分子3-羟基邻苯醌缩合而成）。2.2.2供试品溶液的制备 称取对照品0.47 mg于5个10mL.容鞋瓶中，分别加入2mL pH为2、3、4、5、6的缓冲液，超声使其溶解，再置于60～65℃水浴锅上保存12h后用微孔滤膜（0. 45um）滤过，即得供试品溶液。2.2.3将供试品溶液分别按上述色谱条件测定B - PGG在不同pH条件下水解12 h后没食子酸及PGG含量的变化趋势。3结果3.1 在pH2～5的范围内，随着pH值的不断增大，β-PGG的含量呈现下降的趋势；当pH5～6时，β- PGG含量上升（见图1）。pH值升高，β- PGG的水解反应加强，β—PGG含量下降。β-PGG的水解反应是可逆的，故pH值5—6时的β-PGG含量上升现象，可能是因为水解产生的没食子酸又重新结合在葡萄糖的羟基上形成β- PGG所致。3.2在pH2～5的范围内，随着pH值的升高，没食子酸含量呈现上升趋势（见图2）。pH5—6时没食子酸的含量下降，其原因可能是没食子酸与葡萄糖又重新酯化形成β-PGG，或者是没食子酸进一步形成棓酚等化合物。4结论β- PGG是含鞣质类中药的天然多酚类活性产物，通过实验，测定并分析β-PGG在不同pH条件下的含量变化情况，有助于了解β- PGG的化学稳定性，为进一步研究β—PGG的理化性质提供一定参考。参考文献：[1]王维聪，王潮，宋学英，等.44种中药巾1，2，3，4，6-五-O-没食子酰-β-D -葡萄糖含量的测定[J].中国中药杂志，2008，33（6）：656 -658.[2]赵勇，王红，王宝恩.中药水解类鞣质PCC的研究进展[J].临床和实验医学杂志，2013，12（6）：463 -465.[3]李霄，艾萍.RP - HPLC双波长法测定白芍中芍药苷和五没食子酰葡萄糖含量[J].北京中医药大学学报，2009，32（2）：123-125[4] JinhuiZhang， LiLi，Sung - Hoon Kim， Ann E.Hagerman ，Juxuan Lu An-ti-cancer， anti - diabetic and other pharmacologic and biological acLiv-ities of penta-galloyl-glucose[J].Pharm Res ，2009 ，26（9）：2066.[5]吴雪钗，于波涛，候艾林，等，没食子酸稳定性研究[J].西南国防医药，2006，16（5）：485-486.[6]张迎杰，傅杰，刘林，等没食子酸在含盐酸高温液态水中的稳定性[J].化学反应工程与工艺，2013，29（2）：189-192.（收稿日期：2014-11-26）