凉血退赤方含药血清对人脐静脉内皮细胞VEGF、bFGF、ANG —1及PEDF表达的影响

祁燕 万春平 郑喜 马珊

摘要：目的研究凉血退赤方（LXTCF）含药血清对人脐静脉内皮细胞（ ECV304）血管内皮生长因子（VE（；F）、碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、促血管生成素1（ANG-1）及色素上皮衍生因子（PEDF）基因及蛋白表达的影响，探讨其抑制角膜血管新生的可能作用机制。方法 制备LXTCF含药血清，以不同浓度的LXTCF含药血清（10%、20%）作用于ECV304，以正常大鼠血清（10%、20%）处理的ECV304为空白对照组，以单纯培养体系处理的ECV304为正常对照组。采用Western Blot.实时荧光定量PCR（RT一PCR）检测ECV304细胞VEGF、b-FCF、ANC-1及PEDF蛋白及基因表达的变化。结果 与空白对照组（ 20%）[（0.695±0.028），（1.28±0.08）]比较，20% LXTCF含药血清可明显降低ECV304细胞VEGF[（0.416±0.053），（0.56 +0. 13）]，b-FGF[（0.306±0.053），（0.64±0.11）]蛋白及基因表达（P<0.05）；含药血清（10%、20%）对ANC一1及PEDF蛋白及基因表达均无明显影响（P>0.05）。结论 下调VEGF和b- FCF基因及蛋白表达，从而抑制角膜血管新生，可能是LXTCI治疗CRNV性疾病的机制之一。

关键词：凉血退赤方；角膜新生血管；人脐静脉内皮细胞；血管内皮生长因子、人碱性成纤维生长因子、促血管生成素-1.色素上皮衍生因子

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0061 - 04正常的角膜组织透明，是屈光介质之一。炎症失调、角膜移植排斥反应、碱灼伤、角膜溃疡、角膜干细胞缺失等呵引起角膜新生血管（ corneal neovascularization，CRNV）发生[1]。CRNV破坏了角膜的正常微环境，使眼前节相关免疫赦免偏离消失[2]，并导致持续性炎症和组织瘢痕化，产牛角膜混浊最终导致失明，因此，对CRNV发病机制和治疗方法的研究，一直是眼科领域的热点和难点。内皮细胞（ EC）在NV发生、形成过程中发挥着重要的作用[1]。本实验选用人脐静脉内皮细胞株（ ECV304）作为体外研究对象，从“热郁肝肺”认识CRNV，以“清肝肺郁热，凉血退赤”立论，探讨凉血退赤方（Li-ang Xue Tui Chi formula，LXTCF）抑制CRNV生成的作用及机制，为临床CRNV性疾病的治疗提供理论依据和治疗途径。1 材料与方法1.1 药物LXTCF药材组成为临床常用清热凉血药物密蒙花、生蒲黄、木贼、水牛角、海螵蛸等。药物由云南中医学院第一附属医院中药房提供，并经云南中医学院中药鉴定教研室鉴定。1.2 细胞人脐静脉血管内皮细胞（ HUVEC）株ECV304，购自广州吉妮欧生物科技有限公司。1.3 主要试剂RPMI-1640培养基购自CibcoBRL公司；胎牛血清购自Hyclone；RIPA蛋白提取试剂盒购白碧云天；总RNA提取试剂盒购自天根；逆转录试剂盒及SYBR Premix ExTaqⅡ均购自于TaKaRa；一抗兔抗大鼠抗体（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）购自博尔森公司；二抗羊抗兔IRDye 800cw购自Li - Cor；内参GADPH购自cell signaling公司；引物（bFGF、ANG-1、PEDF、VEGF）均由大连宝生物工程有限公司合成。1.4主要仪器恒温C02细胞培养箱（Trermo公司，型号：3111）；红外荧光成像扫描系统（Gene公司，型号：OdysseyCLX）；ABI PCR仪（Gene公司，型号：Veriti）；安捷伦核酸扩增荧光检测仪（Gene公司，型号：MX3000P）。1.5方法1.5.1 含药血清的制备采用SPF级SD大鼠20只随机分为空白对照组与含药血清组。灌胃给药，每日早晚各1次，连续3d，给药组给药剂量为2 mU200 g（人临床等效剂量的10倍，相当于原生药的13.7 g/kg·d），空白对照组给予等容的蒸馏水。末次给药后lh腹主动脉取血，静置30min，3000转离心20min，取上清，56℃灭活30 min，0.22μm的针头滤器过滤灭菌，置于- 80℃冰箱保存备用。1.5.2

Western Blot检测含药血清对ECV304细胞VECF、PEDF、bFGF、ANG -1蛋白表达的影响ECV304以l×I06个/mL接种于6孔板。培养至细胞贴壁80010时，弃旧的培养基，给药组分别加入体积分数为10%、20%的含药血清的培养液，空白对照组加入10%、20%正常大鼠血清培养液。正常对照组加入等量培养液（10%胎牛血清），每组5个复孔，继续培养24h后，提取细胞蛋白，BCA蛋白定量法定量，变性后，以lO%SDS - PAGE电泳分离，转膜，加入对应抗体孵育后，上红外荧光成像扫描系统检测荧光强度。以目的蛋白与GADPH的密度比值作为目的蛋白的相对含量。1.5.3RT - PCR检测含药血清对ECV304细胞VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因表达的影响 细胞分组给药同前，细胞培养完后，取出六孔板，吸去上清液，加预冷的PBS洗1次，加入ImL trizol提取试剂提取细胞总RNA，cDNA合成按TaKaRa逆转录试剂盒说明书操作，采用SYBR Greenl嵌合荧光法于荧光定量PCR仪中进行扩增，GADPH为内参对照。结果采用相对定量法：各处理组相对于正常对照组的目的基因的量= 2-△△Ct。在PCR反应程序结束后，进入仪器自带软件的数据分析界面，设置CADPH为内参基因（nomalize），正常对照组样本为对照样本（ calibrator），仪器自动计算出各实验组基因表达差异倍数及标准差，即2-△△Ct±标准差值。根据基因库中基因序列设计VEGF、PEDF、bFGF、ANG -1基因及内参基因GADPH引物，各基因引物序列见表1。1.6统计学处理 采用SPSS17.0统计软件包进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析，两两比较采用LSD一t检验。2结果2.1 含药血清对ECV304 VEGF、bFGF、ANC -1、PEDF蛋白表达的影响Western blot检测结果显示，20%含药血清作用24h后，与20%空白对照组比较ECV304 VEGF及bFGF蛋白表达明显降低（P<0.05）；各浓度（ 10%，20%）含药血清对ANG -l、PEDF蛋白表达均无明显影响（P>0.05），见表2、图1。2.2 含药血清对ECV304细胞VEGFmRNA、bFCF mRNA、AN（； -l mRNA、PF DF mRNA表达的影响 检测所提取样本总RNA A260/A280在1.8～2.0之间，RNA较纯，无蛋白质污染，内参及目的基因标准曲线相关系数大于0. 99，扩增效率90%～ 120%之间，可用2-△△Ct计算基因相对表达量。内参及目的基因溶解曲线峰形单一，扩增产物特异性较好。实验结果表叫，含药血清作用于细胞24h后，与20%空白大鼠血清对照组比较，ECV304细胞VEGF mRNA表达明显降低（P<0.05）；各浓度含药血清作用于细胞24h后，对ECV304胞内ANG-1mRNA、PEDF mRNA表达均无明显影响（P>0.05）3讨论

目前认为角膜新生血管的发生与促血管形成因子和抗血管形成因子的平衡失调有关。生理状态下，角膜拈抗血管形成因子和促血管形成因子共同表达，维持平衡。许多研究表明，血管生成刺激因子如血管内皮生长因子与血管生成抑制因子如色素上皮衍生因子之间平衡的破坏是导致新生血管发生的主要原因[3]。血管内皮因子（VEGF）是主要的促血管生成因子[4]，抑制VEGF的表达即可抑制新生血管的形成[5]；VEGF、的表达与CNV的形成成正相关，VEGF可刺激血管内皮细胞增殖，进而促进新生血管的形成[6]。bFGF是血管新生的主要诱导因子且和VEGF有协同作用，甚至有报道bFGF促进脉络膜毛细血管细胞增殖作用强于VFGF[7]，血管生成索1（Ang -1）也是特异作用于新生血管发生的主要细胞内皮细胞的一类促新生血管细胞冈子。其可拮抗血管内皮细胞凋亡，促进培养内皮细胞迁移和形成管状结构，维持内皮细胞的静息状态和血管的完整。还可加强VEGF和内皮细胞生长因子（ EGF）促血管网存活的作用。当以上机制发乍住视网膜或者脉络膜，就起到了促使CRNV形成的过程[8]。色素上皮衍生因子（ PEDF）具有抑制血管生成的功能。在体外实验中，PEDF能抑制内皮细胞的迁移，能使bFGF诱导的毛细血管减少40%，被认为是最有效的天然的血管生成抑制剂，PEDF在晚期CRNV的RPE细胞中有高度上调的表达，抑制CRNV的发展[9]。

“角膜”在中医眼科学中称为黑睛，属于五轮中风轮，内应肝胆，黑睛疾病治则祛风清热、退翳明日。本课题从“热郁肝肺”认识CRNV以“清肝肺郁热，凉血退赤”立沦治疗CRNV，希望能挖掘出中医药治疗CRNV类疾病的巨大优势潜力.

本课题前期研究结果表明[10]，20%凉血退赤方含药血消可显著降低人脐静脉内皮细胞ECV304细胞培养上清中VEGF含量。本研究进一步在人脐静脉内皮细胞模型上，研究凉血退赤方对促血管形成因子（VECF、bFGF和Ang-1）和角膜拮抗血管形成因子（ PEDF）的调控作用，揭示凉血退赤方抑制新生血管形成的分子机制。实验结果显示，20%含药血清可降低ECV304细胞VEGF及bFGF基因及蛋白表达，但对ANG -1及PEDF表达无明显影响。以L研究结果提示，凉血退赤方可能通过下调促血管形成冈子VEGF及b-FGF的表达，进而抑制角膜新生血管的形成。但本研究只观察了含药血清对正常培养状态下细胞VECF等指标的影响，而在刺激或有损伤冈素作用下含药血清对ANC -1、PEDF等冈子表达的是否有影响，及其相关的调控机制、信号传导途径，仍有待于进一步的研究。参考文献：[1] Penn JS，Madan A，Caldwell RB，et al.Vascular endothelial growth factor in eye disease[Jl. Prog Retin Eye Res，2008.27（4）：331 – 371[2] Dana MR，Streilein JW.Loss and restoralion of immune privilegein eyeswith corneal neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sei， 1996，37.2485 - 2494.[3] Miller JW. Vascular endothelial growth factor and ocularneovascularization[J]. Am J Pathol，1997 ，151（1）：13 - 23.[4]刘志刚，陈芳育，蒋立辉，等.血管抑素下调舌鳞癌细胞血管内皮生长因子的表达[J].第三军医大学学报，2008，30（16）：1557 - 1560.[5]刘子彬，刘海俊，许丹丹，等.血管抑索对内皮细胞VEGF表达的影响[J].中国美容医学，2012，21（7）：1165 -1167[6]丁怡，张明昌.CD105和血管内皮生长因子在大鼠角膜新生血管中的表达[J].华中科技大学学报，2010 ，39 （2） ：221-224.[7] Zubilewicz A，Hecquet C，Jeanny J，et al. Find all citations hy this au-thor（ default）. Orfilter your current searchFind all citations by this au-thor（ default）. Orfilter your current searchTwo distinct signalling path-ways are involved in FCF2 - stimulated proliferation of choriocapillaryendothelial cells ：a comparative study with VEGF-[J] . Oncogene，2001 ，20 （ 12 ） ：1403 - 1413.[8]王应利，惠延年，血管生成素1对视网膜新生血管形成的作用及其机制[J].中华眼底病杂志，2007，3（23）：149-152.[9]汪浩，王文吉.脉络膜新生血管的治疗进展[J].国外医学眼科分册，2001：25：288 - 295.[10]马珊，马俊，彭华，等，凉血活血中药含药血清对人脐静脉内皮细胞增殖的影响[J].昆明医科大学学报，2012，11（33）：38 -41.（收稿日期：2014-09-21）