三七总皂苷对大鼠急性重症胰腺炎腺泡细胞钙超载的调节机制2

董文志 马加庆 刘志恒 莫小华

摘要：目的探讨三七总皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺组织中钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ一γ（CaMKⅡ-γ）mRNA表达，降低细胞钙超载的程度，减轻急性重症胰腺炎时胰腺组织的损伤。方法15只SD大鼠随机分成假手术组（so组）、急性重症胰腺炎组（SAP组）及三七总皂苷组（PNS组）。采用经肠壁逆行胰胆管注射法建立急性重症胰腺炎大鼠模型，假手术组开腹后仅翻动十二指肠。三七总皂苷组（PNS组）建模前1h使用腹腔注射三七总皂苷（50mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/l00g）.所有实验分组在建模24h后处死大鼠留取胰腺组织。使用流式细胞仪检测、分析腺泡细胞内钙离子浓度（使用荧光强度表示钙离子浓度），采用逆转录聚合酶链式反应检测胰腺组织CAMKⅡ- γmRNA表达的变化，并比较各组大鼠胰腺组织病理变化。结果SAP组和PNS组胰腺组织中CAMK II -γmRNA表达显著增高（P<0.05），PNS组较SAP组CAMKⅡ- γmRNA表达量显著下降（P<0.05）。通过流式细胞仪检测钙离子浓度提示：SO组、SAP组、PNS组三组胰腺细胞内Ca2的荧光强度具有统计学差异，SAP组和PNS组较so组大鼠胰腺细胞内Ca2+的荧光强度均有显著升高（P<0.05）。与SAP组相比，PNS组大鼠胰腺细胞内Ca2的荧光强度均有显著降低（P<0.05）。病理学评分：与s0组相比，PNS和SAP2组大鼠胰腺组织水平均显著增高（P<0.05）。PNS组大鼠胰腺组织病理学评分显著低于SAP组（P<0.05）。结论 SAP发生时，细胞钙超载程度越高，SAP的病情越重。CAMKⅡ一γ的表达量与胰腺炎病情轻重有关，三七总皂苷（PNS）干预可抑制胰腺细胞内CAMKⅡ-γ的表达，从而缓解胰腺细胞内钙超载，可以减轻胰腺组织病理学改变。

关键词：三七总皂苷；急性重症胰腺炎；钙超载；钙一钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ型

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0055 - 04急性重症胰腺炎（ severe acute pancreatitis，SAP）属于急性胰腺炎的特殊类型，其病情险恶、并发症多、病死率较高一直是临床上棘手的问题。其常在早期合并全身炎症反应综合征（ Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS）和多器官功能衰竭（ Multiple Organ Disfunction Syndrome，MODS），其病死率高达20%-30%。目前在SAP的诊治方面虽然取得了不少进展，并发症发生率有明显下[1]，但其病死率却居高不下，而且针对其发病机制的了解还不十分明确2。近年来针对胰腺细胞钙超载的研究越来越受到关注。钙一钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ一γ（CAMKⅡ-γ）是一类由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通过结合后发生自身磷酸化，进而发挥相应的生物学作用。三七总皂苷（ PNS）在治疗胰腺炎方面有着较为长远的历史，目前在临床中也广为使用，其疗效也受到广泛认可本文通过建立大鼠急性重症胰腺炎模型，并给予三七总皂苷进行干预，了解三七总皂苷对胰腺细胞钙超载的调节及其作用机制。1 材料与方法1.1 建模及分组清洁级雄性SD大鼠15只（第三军医大学实验动物中心提供）体重200～ 220 g，分成假手术组（n=5），急性重症胰腺炎（ SAP）组（n=5），三七总皂甙预处理组（PNS组）组（n=5）。造模前禁食24h，自由饮水。SO组仅打开腹腔，翻动肠管。其余2组采用许永春等[3]使用的改良逆行胆胰管注射法逆行注射5%牛黄胆酸钠溶液（Sigma公司），其中PNS组术前30 min腹腔注射三七总皂苷（血塞通注射液昆明兴中制药有限责任公司）。分别于术后24h分批处死大鼠，留取胰腺组织备用。1.2胰腺腺泡细胞内钙离子浓度的检测 取胰腺组织后立即使用胶原酶获得胰腺腺泡细胞悬液。取部分细胞悬液将Fluo -3 - AM（5 μmol/L。）试剂在37℃下避光孵育细胞30 min，后洗净细胞外荧光。在荧光显微镜下观察胰腺腺泡细胞内钙离子的显影（图1）。使用流式细胞仪（ FCM）中调整加载后的胰腺细胞悬液，使其细胞浓度为5×108个/L。洗净细胞外荧光，应用FCM（激发波长488 nm）随机测定单个胰腺细胞的荧光强度值，取1 x104个/L胰腺细胞内钙离子的荧光强度的平均值。1.3胰腺组织病理学评分经腹腔获取胰腺组织，取大小约0.5cm×0.5cm×0.5cm胰腺组织用10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、4μm切片、HE染色后，光镜下观察胰腺组织的病理改变。按照采用改良Grewal等[4]的方法对SAP大鼠胰腺组织损伤进行定量评估。1.4实时定量荧光PCR测定CaMKⅡmRNA表达水平40～50 mg胰腺组织，采用TRIzol试剂冰上提取胰腺组织总RNA.逆转录为cDNA。以cDNA为模板，荧光标记物、探针及引物由广州富能科技有限公司提供，内参基因为CAPDH（产物为123bp）、目的基因为CaMKⅡ-γ（产物为96bp）。扩增体系反应条件：95℃ 10 min变性，95℃ 15S、600℃ 30S、72℃ 45S.这样循环40次。在7500快速实时定量PCR系统中进行体系扩增和结果分析，得出每一样品的循环荧光域值（Ct值）。反应完成后再于95℃ [5S、60℃l min、95℃15 S后绘制熔解曲线。使用Schmittgen和Livak设计的阈值法来测定目的基因的相对表达水平。目的基因量=2 -△△Ct，△△Ct=（Ct目的基因- Ct管家基因）实验组一（Ct目的基冈- Ct管家基因）对照组。1.5统计学处理以SPSS1 1.7软件进行统计分析。所有数据以均数土标准差表示，进行方差齐性检验，根据样本的性质采用单凶素方差分析、LSD -t检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1胰腺细胞内[Ca2+]i的荧光强度S0组、SAP组、PNS组3组之间胰腺细胞内Ca2的荧光强度具有统计学差异。SAP组和PNS组2组大鼠胰腺细胞内Ca2的荧光强度均有显著升高（P<0.05）。PNS组大鼠胰腺细胞内Ca2的荧光强度较SAP组有显著降低（P<0.05），见表1、组图2。2.2胰腺组织病理学评分SAP组、PNS组2组开腹后肉眼可见胰腺组织均出现了肿胀、渗出、点状出血、局灶性坏死。SO组、PNS组和SAP组3组大鼠胰腺组织病理学评分具有统计学差异（P<0.05）。S0组大鼠胰腺组织病理学评分较SAP组及PNS组显著降低（P<0.05），PNS组较SAP组显著降低（P<0.05）见表1、组图1。2.3胰腺腺组织CaMKII -γmRNA表达水平SAP组、PNS组和so组3组胰腺组织在96bp处均能见到有CAMKⅡ一γmRNA的PCR产物的条带，其阳性内参CAPDH mRNA的PCR产物也可以在123bp处可见。通过统计学分析可知，SAP组和PNS组2组CAMKⅡ-γmnRNA的表达水平显著高于SO组（P<0.05），而PNS组的表达水平则低于SAP组（P<0.05）。见表l、组图3。3讨论

关于急性重症胰腺炎的发病机制，同前的研究的学说众多。其主要包括：胰酶消化学说、炎性因子过度激活学说、氧化应激学说、肠道细菌感染、微循环障碍、细胞调亡学说、基因多态性学等。近年来针对“钙超载”学说的研究愈来受到关注。曾孝征和范维珂研究发现存胰管高压、乙醇、病毒、缺氧以及高钙血等情况下都会引起胰腺腺泡细胞内游离Ca2+的浓度升高，从而诱发胰腺炎的发生[5-6]。临床工作中发现高钙血症患者更容易发生急性胰腺炎，同时大量文献也提示胰腺炎患者血钙浓度会降低[7] 正常情况卜，胰腺腺泡细胞内Ca2+稳定在150mmol/L，水平左右，而胞内游离Ca2+含量很少，但是游离Ca2是重要的第二信使，通过调控符种信号通路而影响细胞活动及功能。当腺泡细胞内Ca2这种稳态会火衡则会诱发胰腺炎。在动物胰腺炎模型中发现在胰腺炎早期胰腺组织内Ca2+会异常积聚，并且积聚程度与胰腺炎发展成正相关。体外实验中也发现腺泡胰晦活性有赖于外源性Ca2+的浓度，相反降低这些外源性Ca2+的浓度也可以减少胰酶的激活[8]

钙一钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKⅡ）足一类由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通过结合后发生自身磷酸化，参与细胞内多种信号通路，完成各种生物功能。CaMKⅡ有α、β、γ、δ4种亚型，而α、β这两种亚型重要在神经细胞内表达。而在胰腺组织中主要以γ型表达。纯化的在钙/钙调素（ Ca-+/CaM）缺失时几乎没有生物活性，有研究发现CaMKⅡ在与钙/钙调素结合后其活性最少增加200倍[9]。这种结合会引起分子构象即改变，使分子中抑制结构域发生自身磷酸化，并依次磷酸化细胞中的其它靶蛋白，从而表现出钙/钙调素依赖性的生物学活性。胰腺细胞内Ca2进入细胞主要通过细胞内外的钙离子通道来实现，而CaMKⅡ则磷酸化细胞膜上的L型钙通道以及相关的调节蛋白，是通道开放大量Ca2进入细胞[10]。同时还可以去除肌质网上的抑制蛋白，导致肌质网上钙通道打开，大量Ca2进入细胞内，引起细胞内钙超载。

目前三七总皂苷对于胰腺炎的治疗已经十分常见，也得到了临床实践的认可。张恒[11]：在对70例临床胰腺炎患者治疗观察，通过统计患者血中C反应蛋白变化发现奥曲肽联合三七总皂苷在急性胰腺炎的综合治疗中可发挥协同作用，疗效优于单用奥曲肽。在动物实验中==七总皂苷在治疗胰腺炎的机制方面在炎性因子、氧自由基方面报道较多[12]，但对于钙超载报道较少。在对严重烧伤后机体免疫系统功能的研究发现中药三七皂苷对肌醇脂质信号系统巾IP3一CaM途径具有较好的调理作用[13]。在对大鼠脑组织缺血再灌注研究发现三七总皂苷可以减少大鼠海马及皮层CaMKⅡ-βmRNA及蛋白表达[14]。在本实验中，通过对大鼠胰腺炎治疗24h各项检测指标发现：使用三七总皂苷可以减少胰腺的病理损伤，对胰腺组织起到保护作用。运用流式细胞仪检测细胞的荧光强度提示三七总皂苷对于胰腺腺泡细胞钙超载有所缓解。在使用实时定量荧光PCR测定CaMKⅡmRNA表达水平表明，三七总皂苷可以降低由于胰腺炎而升高的组织内CaMKⅡmRNA的表达水平。综上所述，胰腺炎的发病机制中钙超载起到十分关键的作用，三七总皂苷可以通过减少组织内CaMKⅡmRNA的表达水平从而减低细胞内Ca2的浓度。而对于CaMKⅡ的蛋白水平的影响和临床中对患者体内的变化，仍需要进一步研究。参考文献[1]UhlW， ISENMAN N R，CURTI G， et al. Influence. of etiology on thecourse and outcome of acute pancreatitis. Pancreas， 1996，13（1）：335-343.[2] MCNAMARA D.Pancreatic diseases[J].Aliment Pharmacol Ther，2003 ，18（ Suppl）：60 - 65.[3]许永春，李兆申，屠振兴，等.改良逆行胆胰管注射法制备轻重不同两种大鼠急性胰腺炎模型.第二军医大学学报，2004 ，25（11）：1251-1252.[4] GREWAL HP， MOHEY EL DIN A， GABER L，et al.Amelioration ofthe physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using ananti - TNF - alpha polyclonal antibody[J].Am J Surg，1994：167（1）：214 - 218.[5]曾孝征.组织学与胚胎学[M].北京：人民卫生出版社，2004：219 – 222.[6]范维珂，胰腺的病理生理学[M].（下册）.上海：上海科学技术出版社，1984：419-425[7]李祖铭，急性胰腺炎患者血清白蛋白、葡萄糖、钙水平的变化及临床意义[J].内科急危重症杂志，16（3）：149-150.[8] CRIDDLE DN， CERASIMENKO JV， BAUMGARTNER HK， etal. Calcium signaling and pancreatic cell death：apoptosis or[J].CellDeath Differ 2007 ，14：1285 - 1294.[9] HOWARD S. Phosphorylation of microtubule - associated proteins hy acalcium/calmodulin - dependent protein kinase[J] J Cell Biol，1984，99（7）：11 -19.[10] CURRIE S.Cardiac ryanodine receptor phosphorylation by CaM Ki-nase U：keeping the ba lance right， Front Bioscl，2009 ，14（1）：5134-5156.[11]张恒，倪鸿昌.奥曲肽联合三七总皂苷在急性胰腺炎综合治疗中的疗效观察[J].安徽医药，15（12）：1581 -1583.[12]葛忠，张东生，胡义利，等.三七皂苷和善宁对大鼠急性重症胰腺炎治疗作用的比较研究[J]，中国现代医学杂志，14（12）：17 – 22.[13]罗中华，蔡绍丽，黄文华，等.三七皂苷对烫伤小鼠巨噬细胞IP3CaM信号途径的影响[J].第三军医大学学报，2001 ，23（8）：925 - 927.[14]牛增强，闫玉仙，马春玲，等三七总皂苷对吗啡戒断大鼠海马组织aMKⅡ活性及CaMK Ⅱα亚基蛋白表达的影响[J].中国药物依赖性杂志，2008 ，17（2）：102-105（收稿日期：2014-11-07）