短乳杆菌JH-1体外降胆固醇机理的初步探讨

姜 华，陆兆新（1．南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095;2．徐州医学院公共卫生学院，江苏徐州 221004）

胆固醇又称胆甾醇，是人体必需的营养成分，具有很多重要生理功能，如参与血浆脂蛋白合成，转化为胆汁酸盐，合成类固醇激素等［1］。然而，体内过多的胆固醇积累严重威胁着人类的健康。研究表明，动脉粥样硬化、冠心病、脑中风等心血管疾病发生率的不断提高与胆固醇的不正常代谢密切相关［2］。

自20世纪70年代以来，人们发现定植于肠道的微生物具有显著降低血清胆固醇水平的能力。这些研究成果已引起国内外营养学、医学、微生物学等各界人士的普遍关注，其中以乳酸菌降解血清胆固醇水平的研究最多［2－5］。迄今，已有大量研究证实不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果。但是，目前关于乳酸菌降解胆固醇作用机理尚未定论。普遍认为，这是以下3种机理协同作用的结果［6－8］。①共沉淀作用:乳酸菌产生的胆盐水解酶（Bile salt hydrolase，BSH）可催化肠道中的结合型胆盐水解成去结合胆酸，其溶解度降低且形成沉淀后排出体外，促使更多的胆固醇代谢合成新的胆汁盐，降低血清胆固醇浓度;②同化作用:乳酸菌将胆醇吸收至细胞内，从而降低体内环境中胆固醇浓度;③掺入细胞膜:胆固醇可以在乳酸菌生长过程中结合到菌体细胞膜或细胞壁上。笔者以实验室前期筛选的具有降解胆固醇性能的短乳杆菌JH-1为研究对象，初步探讨短乳杆菌JH-1降解胆固醇的作用机理，为开发新型降胆固醇乳酸菌制剂提供理论基础。

1 材料与方法

1．1 主要试验材料

1．1．1 菌株。短乳杆菌Lactobacillus brevisJH-1，由南京农业大学食品科技学院酶工程实验室保藏。

1．1．2 试剂。胆固醇标准物质，分析纯，纯度99%，美国sigma公司;乙腈、异丙醇、甲醇，色谱纯，美国Tedia公司;其他试剂均为国产分析纯。

1．1．3 培养基。MRS培养基组成为:蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏 5 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，柠檬酸三铵2．63 g，磷酸氢二铵2 g，七水硫酸镁0．58 g，一水硫酸锰 0．20 g，Tween-80 1 ml，蒸馏水1 000 ml。固体培养基在液体培养基的基础上添加1．5%的琼脂。

高胆固醇MRS-CHOL培养基［9］配制方法为:准确称量胆固醇0．1 g放入小烧杯中，加入0．2 g牛胆盐、0．1 g蔗糖酯、1 ml吐温80搅拌均匀，再移取5 ml冰乙酸加热溶解，把溶解液用超声波处理15 min后，快速加入到配制好的液体培养基中，边加入边搅拌，使其形成均匀、稳定的胶体溶液。

1．1．4 主要仪器。Agilent 1100高效液相色谱，美国Agilent公司;UV-2450紫外分光光度计，日本岛津;centrifuge 5804R高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司;电子精密天平，德国Sartorius;SW-CJ-IBU超净工作台，苏州净化。

1．2 试验方法

1．2．1 菌种活化。将－20℃保存的短乳杆菌Lactobacillus brevisJH-1转接至MRS斜面培养基，37℃培养24 h，然后挑取一环菌接种于液体MRS培养基，37℃培养24 h，如此转接培养2次，即为活化菌种。

1．2．2 胆固醇共沉淀作用分析。取经活化的短乳杆菌Lactobacillus brevisJH-1培养液2 ml，分别接种于100 ml含有牛胆盐和不含牛胆盐的 pH 为 4．0、5．0、6．0、7．0 的 MRS-CHOL培养基中，37℃培养24 h。分别取上述培养物10 ml，于4℃、10 000 r/min离心10 min，取1 ml上清液备用;弃除上清液，用10 ml无水乙醇重悬菌体，于4℃、10 000 r/min离心10 min，取1 ml洗涤液备用;弃除洗涤液，加入10 ml无水乙醇重悬菌体，冰水浴超声波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），4℃、10 000 r/min离心10 min，上清即为菌体破碎液。采用高效液相色谱法，测定上述培养物的发酵上清液、菌体洗涤液和菌体破碎液中胆固醇含量。

1．2．3 胆固醇同化作用分析。取经活化的短乳杆菌Lactobacillus brevis JH-1培养液2 ml，分别接种于100 ml MRSCHOL培养基中，37℃培养4 h后，每隔4 h取样50 ml，于4℃、10 000 r/min离心10 min。取10 ml上清，加入5 ml乙酸乙酯，混匀后静置萃取过夜，取上层萃取液1 ml，挥干后加入1 ml无水乙醇，以0．22 μm灭菌滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液进行HPLC分析。

菌体沉淀用10 ml无水乙醇重悬洗涤，于4℃、10 000 r/min离心10 min。弃除洗涤液，再加入10 ml无水乙醇重悬菌体，冰水浴超声波破碎（400 W，工作5 s，歇10 s，共10 min），并于4℃、10 000 r/min离心10 min，上清即为菌体破碎液。取上清液4 ml，挥干后加入1 ml无水乙醇，以0．22 μm灭滤膜过滤，取滤液作为供试品溶液进行HPLC分析。

1．2．4 菌体细胞对超声波的抗性。取经活化的短乳杆菌Lactobacillus brevis JH-1培养液2 ml，分别接种于100 ml MRSCHOL培养基和和MRS液体培养基中，37℃培养24 h后，取10 ml菌液4 000 r/min离心10 min，并且收集菌体沉淀，用生理盐水重新悬浮沉淀，调整菌体浓度为108cfu/ml。取10 ml的重悬液，冰水浴超声波破碎（500 W，工作5 s，歇10 s，共20 min）。破碎菌液用生理盐水稀释，涂布MRS平板计数，以未经超声破碎的菌悬液为对照，研究超声破碎处理对细胞存活率的影响。

1．2．5 HPLC 测定胆固醇含量。

1．2．5．1 胆固醇标准溶液的配制。准确称取胆固醇50．0 mg于25 ml无水乙醇中，并且用无水乙醇定容至50 ml容量瓶中，制成1 g/L胆固醇标准溶液。标准胆固醇工作液配制方法为:取标准胆固醇储备液，分别以无水乙醇稀释，使其浓度分别为 0．125、0．250、0．500、0．750 和 1．000 g/L。

1．2．5．2 色谱条件。参照谭来勋等［10］建立的胆固醇高效液相色谱法进行，略有改动。具体色谱条件如下:色谱柱为美国Agilent公司反向色谱柱 ZORBAX．Eclipse XDB-C18柱（4．6 ×250 mm，5 μm）;流动相 A（乙腈 +1‰ 三氟乙酸）—流动相B（异丙醇）按60∶40的比例进行等梯度洗脱，流速为0．5 ml/min;柱温40℃;检测波长为205 nm。胆固醇标准物质或样品溶液20 μl进样。洗脱时间15 min。

1．2．5．3 标准曲线的绘制及样品中胆固醇浓度的计算。分别取20 μl标准胆固醇工作液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。分别取20 μl样液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定样液的峰面积，由标准曲线回归方程式计算样液中胆固醇含量。

2 结果与分析

2．1 色谱图结果 采用高效液相色谱法，测定胆固醇标准溶液和样液中胆固醇的浓度。胆固醇标准物质的保留时间为11．503 min（图1a）。按照“1．2．2”中的方法对样品进行处理后，发酵液上清液中胆固醇的保留时间约为11．5 min（图1b）。可见，胆固醇的前后无干扰峰，已与样品中其他物质得到很好的分离。

2．2 标准曲线绘制及样品中胆固醇浓度的计算 以峰面积（y）对胆固醇标准溶液浓度（x）作线性回归，制作胆固醇标准曲线（图2）。当胆固醇标准溶液浓度在0～1．0 g/L范围内，胆固醇获得较好的分离，其线性方程为y=13 997x+315．62（R2=0．999 5）。将样品溶液的峰面积代入回归方程，即可计算出样品溶液中胆固醇的含量。

2．3 胆固醇共沉淀作用分析 Klaver等［11］提出，去结合型胆汁盐在较低的pH条件下（pH＜6），可以同胆固醇共同沉淀析出，因此发生共沉淀需要同时具备酸性环境和胆盐两个条件。由图3可知，短乳杆菌JH-1在含有胆盐与不含胆盐的MRS-CHOL中培养后，2种菌体洗涤液中胆固醇含量基本没有变化。当含有胆盐且 pH 为4．0、5．0、7．0时，菌体洗涤液中胆固醇含量为0;当pH为6．0时，洗涤液中胆固醇含量0．54%。根据共沉淀作用发生所需的两个条件，发现在酸性条件下短乳杆菌JH-1并没有发生共沉淀现象。研究结果表明，共沉淀作用不是短乳杆菌JH-1降胆固醇的途径。

2．4 胆固醇同化作用分析 通过对短乳杆菌JH-1不同培养时间的发酵上清液和菌体破碎液中胆固醇进行HPLC测定，同时得出发酵上清液与菌体破碎液中胆固醇峰面积的变化趋势。由图4可知，在短乳杆菌JH-1发酵过程中，上清液胆固醇含量逐渐下降，经超声波处理后细胞破碎液中的胆固醇含量持续上升，培养24 h后破碎液中胆固醇浓度占30．03%。研究结果表明，同化作用是短乳杆菌JH-1降胆固醇的主要途径。

2．5 菌体细胞对超声波的抗性 将菌悬液用超声波在500 W下处理20 min后，研究短乳杆菌JH-1在不同培养条件下的菌体细胞对超声波的抗性。Noh等［11－14］分别对加胆固醇和不加胆固醇的培养基下生长的乳酸菌进行超声处理，发现前者更耐超声处理，原因可能是吸收到细胞壁（膜）中的胆固醇改变了细胞的组成，增加了膜的韧性，从而使菌体抗性增强。由图5可知，超声波处理对短乳杆菌JH-1影响较大，在高胆固醇培养基MRS-CHOL的菌体的存活率比在MRS液体培养基中培养的菌体细胞的存活率高30%。这说明胆固醇被短乳杆菌JH-1吸收到细胞壁（膜）中，增加了膜的韧性，从而增强了菌体抗性。

3 结论与讨论

该研究对前期实验室筛选得到的短乳杆菌JH-1体外降胆固醇的机理进行了初步探讨。通过分析同化作用、共沉淀作用和掺入细胞膜3种乳酸菌降胆固醇作用机理，初步判定短乳杆菌JH-1体外降胆固醇作用是同化作用和掺入细胞膜共同作用的结果。与常规的胆固醇测定方法比色法相比，该研究采用HPLC法测定发酵上清液与细胞破碎液中的胆固醇。试验结果更准确、可靠。此外，短乳杆菌JH-1是从金华火腿中分离得到的一种乳酸菌，是一种公认安全的菌种，因而具有较高的安全性。这为后续研究降胆固醇乳酸菌制剂奠定了理论基础。

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