金花茶遗传多样性研究进展

莫杰姝，曾 进 ，甘春雁，卢成阳

(1.广西大学，广西南宁 530004;2.广西省南宁市金花茶公园，广西南宁 530022;3.广西省南宁青秀山风景名胜旅游开发有限责任公司，广西南宁 530029;4.广西省钦州市海洋局，广西钦州 535000)

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生命进化和物种分化的基础，有广义和狭义的定义之分［1］。广义的遗传多样性是指地球上所有储存在生物个体基因之中的各种遗传信息的总和;狭义的遗传多样性是指生物种内显著不同的种群之间以及同一种群内不同个体之间的遗传变异总和［1］。因此，对遗传多样性的研究可以更好地了解物种种间及种内群体间遗传结构的动态分布和多态性水平，对物种起源、种源区划、品种鉴定、良种选优、合理开发及利用、就地保护和迁地保护物种种质资源等具有十分重要的指导意义。

金花茶属国家一级珍稀保护植物，具有极高的观赏价值、营养价值和药用价值等，被世界誉为神奇的东方神茶、“植物界的熊猫”以及“茶族皇后”。因其具有极高的观赏价值、营养价值和药用价值，对金花茶的研究越来越多，从地理分布区域［2-4］、繁殖方式(扦插繁殖、压枝繁殖、组织培养)［5-14］、引种驯化［15-18］、化学成分［19-23］、药用价值［24-27］到遗传多样性等的研究，金花茶越来越多的潜能被发现。笔者主要从形态学水平、细胞学水平、生化水平以及分子水平4个方面对金花茶遗传多样性研究进展进行概述，为今后金花茶的资源保护、开发与利用提供理论依据。

1 金花茶品种

金花茶(Camellia chrysantha)首次于1960在我国广西被发现，目前世界上已知的金花茶有42种5变种，分布最多的位于广西南部及西南部，产29种5变种;其次是越南北部，产10种，其余分布于我国云南、贵州、四川，各产1种［28］(表1)。

2 金花茶的遗传多样性研究

2.1 形态学水平 形态学标记遗传多样性研究是指通过利用植物的外部特征特性来检测植物遗传变异的一种既简便易行又快速的方法，此方法主要是根据表型上的差异，如株高、株型、花色、花型、叶型等所表现出来的差异来反映基因型上的差异。而通过表型性状来研究的遗传多样性，通常表现为符合孟德尔遗传规律的单基因性状，以及多基因决定的数量性状。对植物种植资源的分类、鉴定和育种材料的选择通常是依据表型性状来开展研究的。但表型性状在生长发育阶段易受到外界因素的影响，且表现的数量极其有限，因此，此种方法对植物种植资源更深层次、更细化的研究具有很大的局限性［29］。

叶创兴等［30］根据表型分类把倒卵金花茶作为柠檬金花茶的同物异名;张宏达［31］的分类标准将陇瑞金花茶和毛籽金花茶定义为大弄岗金花茶的同物异名。张宏达［31］和梁盛业［32］均认为防城金花茶和长柱金花茶是金花茶的同物异名，且认为防城金花茶是指亮叶离蕊茶，长柱金花茶则是亮叶离蕊茶的变种。汤忠皓［33］根据金花茶的花型大小、花部结构、花瓣颜色、光泽以及花期等对19个目前已被发现定名以及未定名的金花茶进行分类。叶泉清等［34］认为将弄岗金花茶、毛籽金花茶、陇瑞金花茶、中华五室金花茶、直脉金花茶、多瓣金花茶、武鸣金花茶归并为淡黄金花茶一个种的处理方法并不恰当，他们以花瓣合生高度、花色特征、子房室数、果皮厚度、种皮是否被毛、叶质及厚度与侧脉关系等作为主要分类性状，将毛籽金花茶、陇瑞金花茶处理为弄岗金花茶的异名，把直脉金花茶、多瓣金花茶处理为中华五室金花茶的异名，而武鸣金花茶为独立种。吴洪明［35］运用生理指标测定福建金花茶组植物的耐寒性，表明金花茶‘金坛洛’耐寒性较强，大弄岗金花茶‘金陇瑞’稍差。戴月等［36］通过对顶生金花茶和平果金花茶在分布、形态特征、物候期等方面进行观察，发现这2种金花茶在这几个方面均有明显的差别，且认为顶生金花茶为平果金花茶的变种并不合适，主张顶生金花茶和平果金花茶为2个独立种。

2.2 细胞学水平 细胞学标记多样性主要是染色体多样性，即根据细胞染色体核型及带型特征进行的一种遗传多样性研究方法［37］。染色体是遗传物质的载体，是基因的携带者，因此染色体变异必然会在生物进化过程中导致遗传变异。而检测染色体是否变异，主要是研究植物特定的细胞学特征，如染色体的缺失、易位、倒位、重复或是染色体数目非整倍体的单体、三体、多体等。即表现为染色体核型，即染色体的数目、大小、随体、着丝点位置等，以及带型如C带、N带、G带等方面的变异。随着常规染色体技术、细胞原位杂交技术等染色体研究技术的不断发展走向成熟，因此从细胞学水平上更能表达出植物的遗传多样性，且优于形态变异［38］。

表1 金花茶品种

目前对金花茶染色体组型、核型的研究越来越多，如梁盛业［39］进行金花茶组植物(20种和3变种)核型的比较，黄锦培等［40］对金花茶染色体组型的观察，金花茶染色体数目2n=30;卢天玲等［41］对金花茶和显脉金花茶染色体数目和形态进行比较，结果表明两者核型之间差异明显。廖汉刃等［42］对苹果金花茶、弄岗金花茶、夏石金花茶、小金花茶、倒卵金花茶和小金花茶的花粉染色体进行观察，结果表明这6种金花茶的花粉染色体数目均相同，N=15，且苹果金花茶花粉的核型公式K(n)=11m+3sm+1st，与金花茶、显脉金花茶、凹脉金花茶、毛瓣金花茶和小果金花茶的核型具有显著差异［43］。廖汉刃等［44］对凹脉金花茶、显脉金花茶、金花茶、小金花茶的核型进行比较，结果表明显脉金花茶是这4种金花茶种最原始的种，从染色体的相对长度变化而言，金花茶与小金花茶的核型存在较大差异。秦新民等［45］在1992年对防城金花茶和金花茶的核型进行比较，其核型公式分别为2n=2x=30=20m(2SAT)+10sm;2n=2x=30=22m(2SAT)+8sm，从核型的差异结合形态特征、花粉形态的不同，认为防城金花茶作为金花茶的变种是合理的。而在1993年研究了弄岗金花茶、陇瑞金花茶、武鸣金花茶和凹脉金花茶4种金花茶的核型，其中弄岗金花茶、弄岗金花茶和武鸣金花茶的核型相同［46］。王任翔等［47］对金花茶组的核型进行比较，结果显示这7种金花茶间核型存在明显差异。

2.3 生化水平 生化标记多样性主要体现在蛋白质多样性，即从贮藏蛋白、同工酶等的变异分化来鉴定物种之间、品种之间是否存在遗传差异，亦是鉴定外源DNA和物种起源进化的一种有效而广泛应用的遗传多样性研究方法［38］。基因通过控制蛋白质的结构来控制性状，因此蛋白质是基因的体现者，外界因素的差异以及植物本身因素的差异导致基因转录过程中产生多种转录产物，从而转录成多种蛋白［48］。同工酶是指生物体内因编码基因不同而产生的多种分子结构的酶，而对同工酶的分析也主要是从蛋白质分子水平上进行研究，根据同工酶分子的大小、构象、带电荷数的不同，在电场中运动速度的不同以及形成谱带数目、迁徙率的不同，进而直接鉴定生物群体内物种之间、同一物种不同品种间的遗传差异［37］。因其成本低，所需试验技术较简单，结果易于比较，准确性高，受外界环境影响较小等优点，在植物遗传多样性研究中被广泛应用。

目前从生化水平上对金花茶的研究仍极少。1998年，梁机等［49］对8种金花茶植物的叶片可溶性蛋白质进行研究，结果将8种植物聚类成5类:金花茶与防城金花茶;毛籽金花茶与弄岗金花茶;东兴金花茶与平果金花茶;显脉金花茶;毛瓣金花茶，从而体现出这8种金花茶亲缘关系的远近。

2.4 分子水平 分子标记多样性研究直接体现在对DNA分子的研究上。DNA是组成遗传基因的主要材料，也称“遗传微粒”。因此对遗传信息，即DNA的碱基序列进行比较分析，能够更直接地反映植物间的遗传差异［38］。相对形态学、细胞学、生化鉴定方法而言，DNA分子水平遗传多样性研究具有直接快速、多态性高、准确性高、特异性强、信息量大、微量分析、不存在上位性效应，以及不受自身生长发育状况、环境条件等因素的影响等优点，是目前研究生物遗传多样性最理想的方法。该技术也被逐渐应用于金花茶的遗传多样性研究、群体遗传结构研究、种间亲缘关系研究等领域。目前应用较多的分子标记技术主要有AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR以及ITS序列分析技术等。

2.4.1 AFLP。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)指对DNA限制性酶切片段进行选择性扩增［50］。具有所需DNA样品数量少，多态性强，位点多，稳定性好，重复性强等优点，但目前应用于金花茶遗传多样性分析研究仍较少。

唐绍清等［51］运用AFLP分子标记方法对金花茶组23个种进行分析，结果表明薄叶金花茶、小花金花茶、夏石金花茶和小瓣金花茶之间的亲缘关系很近，且同时验证了毛籽金花茶、陇瑞金花茶、弄岗金花茶和大样弄岗金花茶归并到淡黄金花茶组是正确的。宾晓芸［52］运用AFLP技术对我国分布区的6个金花茶自然居群的遗传多样性研究，揭示了金花茶物种均具有较高的遗传多样性水平，遗传变异主要存在于居群间。

2.4.2 ISSR。ISSR 分子标记(Inter simple Sequence Repeats，简单重复序列区间多态性)是在微卫星分子标记基础上发展起来的一种分子标记［53］，其基本原理与SSR相似，但在引物设计上比SSR相对简单，直接可用引物进行扩增，在提供遗传信息方面更优于RFLP、RAPD、SSR。目前被广泛应用于遗传多样性、基因定位、构建遗传图谱、种质资源鉴定等方面的研究。

2005年，宾晓芸等［54］采用ISSR分子标记对金花茶4个自然分布居群的遗传多样性进行研究，结果表明金花茶总体的遗传多样性水平较高，但居群内的遗传多样性相对较低，遗传变异主要存在于居群间，与运用AFLP分子标记技术研究结果相同。2014年，柴胜丰等［55］采用ISSR分子标记对毛瓣金花茶6个自然居群的遗传多样性进行分析，结果表明毛瓣金花茶在物种水平和居群水平上都表现出相对较高的遗传多样性，且毛瓣金花茶的遗传变异主要存在于居群内，居群间的遗传分化程度较低。肖政等［56］采用ISSR分子标记技术对南宁金花茶公园金花茶组29份样品进行遗传多样性分析，表明金花茶组物种的遗传基础较宽，并将29份金花茶样品进行聚类分成三大类，即扶绥中东金花茶为一类，顶生金花茶和龙州金花茶为一类，其余金花茶聚为一类，其中夏石金花茶和小花金花茶的遗传相似系数最高，弄岗金花茶和毛籽金花茶有着很近的亲缘关系，与唐绍清等［57］研究结果相同。韦霄等［58］对迁地保护的3个人工栽培金花茶居群进行遗传多样性研究，结果表明迁地保护相较野生居群而言，仍能够较好地保护金花茶的遗传多样性水平，且迁地保护的金花茶存在于居群内的基因遗传多样性的概率远高于居群间。

2.4.3 RAPD。RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)与PCR的反应原理相同，即以待测基因组DNA片段作为模板，以碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸(8～10个碱基)作为引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，从而进行多态性分析［59］。RAPD虽然具有DNA样品数量少，操作技术简单，检测简便且速度快，灵敏度高，特异性强等特点，但RAPD的重复性较差，且表现为显性遗传，存在共迁移问题［57］。

施苏华等［60］运用RAPD分子标记技术对11种金花茶物种进行了分析，表明小花金花茶、扶绥金花茶和中东金花茶之间的亲缘关系较近;大样金花茶、薄叶金花茶和夏石金花茶之间的关系较近，龙州金花茶、毛籽金花茶、陇瑞金花茶和弄岗金花茶之间的关系亦较近;而凹脉金花茶为单独种，与其他金花茶种亲缘关系相对较远。宾晓芸等［54］运用RAPD分子标记对6个金花茶自然居群的遗传多样性研究，较AFLP、ISSR分子标记技术研究结果的遗传多样性指数略高，均能揭示了这6种金花茶的遗传多样性水平较高。

2.4.4 SSR。SSR 分子标记(Simple Sequence Repeats，简单序列重复)亦称微卫星DNA，是一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。通过直接检测显示不同基因型个体在SSR位点的多态性来分析和鉴别生物体内在核苷酸的排布和其表型显现的规律，从而达到分析其遗传多样性的目的［57］。

唐健民［61］运用SSR分子标记对4个东兴金花茶野生居群进行遗传多样性研究，表明东兴金花茶的遗传多样性较高，遗传分化主要存在于居群内部，且子代野生居群的多样性参数高于母代居群。徐晶等［62］运用SSR技术进行了6个以金花茶为母本，七星白、茶梅品种为父本的所有可能杂交种的鉴定，结果显示除H2外所有可能的杂交种均来自于相应父母本的真杂种，与母本是否来自于不同的金花茶个体关系不大。

2.4.5 ITS。ITS(Internal Transcribed Spacer，核糖 rRNA 内转录间隔区)指在rDNA基因中，由18S区、ITS1区、5.8S区、ITS2区和28S区头尾串联构成的重复序列。ITS序列基因片段具有极大的保守性，亦能表现出极为广泛的序列多态性，因此能实质地反映出属间和种间的碱基对微小的差异，目前已被广泛应用于菌类分类鉴定、植物种质资源鉴定以及亲缘关系非常近的物种或种群分类鉴定等方面［61］。

唐绍清等［57］运用ITS区序列对分布于我国的22个金花茶组物种进行测定，结果显示淡黄金花茶、毛籽金花茶、陇瑞金花茶、弄岗金花茶、大样金花茶和凹脉金花茶的亲缘关系很近，小瓣金花茶、小花金花茶、薄叶金花茶、多瓣金花茶、夏石金花茶和龙州金花茶的亲缘关系也较近。

3 展望

目前，在国内从形态学、细胞学、生化水平以及DNA分子水平上均涉及了对金花茶遗传多样性的研究，揭示了金花茶具有丰富的遗传多样性，为今后金花茶种质资源的基因改良、育种选优、迁地保护、开发及利用等方面的研究提供重要的理论依据。但在金花茶的遗传多样性研究中仍存在一些不足:①虽然对金花茶遗传多样性已进行相关研究，但研究的范围并不够全面，在表型、染色体、蛋白质、同工酶方面的研究极少;②在DNA分子水平上对金花茶遗传多样性的研究多采用AFLP、ISSR、RAPD、RFLP、SSR这几个分子标记技术，具有一定的局限性，且大多数是采用一种分子标记技术对金花茶遗传多样性的研究，对研究结果而言，具有片面性、不稳定性;③目前采用常规的方法和分子生物学技术方法相结合对金花茶种质资源的遗传多样性研究仍处于空白。因此，为更全面地利用、开发和保护金花茶资源，建议在今后金花茶的遗传多样性研究中应加强以上几个方面的研究。

［1］葛颂，洪德元.遗传多样性及其检验方法［M］//生物遗传多样性研究的原理与方法.北京:科学出版社，1994:123-140.

［2］吴洪明.福建金花茶组植物种质资源研究与评价［D］.福州:福建农林大学，2004.

［3］苏宗明，莫新礼.我国金花茶组植物的地理分布［J］.广西植物，1988，8(1):75-81.

［4］韦霄，蒋运生，韦记青，等.珍稀濒危植物金花茶地理分布与生境调查研究［J］.生态环境，2007，16(3):895-899.

［5］韦记青，蒋运生，唐辉，等.珍稀濒危植物金花茶扦插繁殖技术研究［J］.广西师范大学学报:自然科学版，2010，28(3):70-74.

［6］郭伦发，林春蕊，何金祥，等.NAA对金花茶扦插成活率的影响［J］.福建林业科技，2008，35(3):106-109.

［7］黎衍，苏巧玲，黎蕾秀，等.金花茶扦插育苗技术研究［J］.广西林业，2008(6):54-55.

［8］张乃燕，王东雪，江泽，等.金花茶嫁接繁殖试验研究［J］.北方园艺，2010(21):34-36.

［9］骆文华，王燕，黄仕训，等.金花茶嫁接繁殖试验［J］.浙江林业科技，2013，33(2):60-62.

［10］韦晓娟，李开祥，廖健明，等.金花茶大砧嫁接试验初报［J］.北方园艺，2013(8):68-70.

［11］廖汉刃，周传明，董学军，等.金花茶组织培养及其试管苗嫁接繁殖试验初报［J］.广西农学院学报，1987(2):66-70.

［12］黄小荣，韦鹏宵.金花茶种质资源的组织培养保存［J］.广西林业科学，2004，33(4):190-194.

［13］廖慕勤，陈平，陈以红.广西七种金花茶的组织培养快速繁殖［J］.实验生物学报，1988，21(1):1-9.

［14］杨舒婷，林茂，王华新，等.崇左金花茶的组培诱导愈伤研究［J］.安徽农业科学，2013，41(1):17-18.

［15］赵晓辉，赵真庆，孙思.引种金花茶组植物的适应性与繁殖试验初报［J］.广东林业科技，2013，29(3):32-35.

［16］苏东霞，莫木信.金花茶在广东肇庆地区的栽培及生长表现［J］.中国园艺文摘，2014(6):164-165，173.

［17］黄国烽.金花茶的引种与栽培技术探讨［J］.农林科技，2013(23):292-293.

［18］杨成华，张廷忠，姚淑均.离蕊金花茶引种繁殖初报［J］.贵州林业科技，1999，27(3):47-50.

［19］唐前，罗燕英，黄连冬，等.金花茶组植物化学成分的定量分析［J］.时珍国医国药，2009，20(4):769-771.

［20］湛志华.金花茶叶中黄酮成分的提取与分离［D］.桂林:广西师范大学，2003.

［21］彭晓，于大永，冯宝民，等.金花茶化学成分的研究［J］.广西植物，2011，31(4):550-553.

［22］沈洁，张可锋，朱华.金花茶的化学成分及其药理作用的研究进展［J］.内蒙古中医药，2011(2):121-122.

［23］林华娟，秦小明，曾秋文，等.金花茶茶花的化学成分及生理活性成分分析［J］.食品科技，2010，35(10):88-91.

［24］陈月圆，黄永林，文永新.金花茶植物化学成分和药理作用研究进展［J］.广西热带农业，2009(1):14-16.

［25］宁恩创，秦小明，杨宏，等.金花茶叶水提物的降脂功能试验研究［J］.广西大学学报:自然科学版，2004，29(4):350-352.

［26］宁恩创，秦小明，杨宏.金花茶口服液加工工艺研究［J］.食品工业科技，2006(1):121-122，125.

［27］韦璐，秦小明，林华娟，等.金花茶多糖的降血脂功能研究［J］.食品科技，2008(7):247-249.

［28］梁盛业.世界金花茶植物名录［J］.广西林业科学，2007，36(4):221-223.

［29］陈灵芝，马克平.生物多样性科学:原理与实践［M］.上海:上海科学技术出版社，2001.

［30］叶创兴，许兆然.关于金花茶组的研究［J］.中山大学学报，1992，31(4):68-77.

［31］张宏达.山茶科的系统发育论析:I.金花茶组与古茶组的比较分析［J］.中山大学学报，1996，35(l):77-83.

［32］梁盛业.中国名优茶花［M］.北京:金盾出版社，2000:1

［33］汤忠皓.金花茶系花的分类［J］.北京林业大学学报，1986(3):44-47.

［34］叶泉清，薛跃规.淡黄金花茶归并种的形态特征比较及分类探讨［J］.中山大学学报:自然科学版，2013，52(3):103-111.

［35］吴洪明.福建金花茶组植物种质资源研究与评价［D］.福州:福建农林大学，2004.

［36］戴月，薛跃规.关于顶生金花茶分类地位的探讨［J］.广西植物，2007，27(6):840-843.

［37］冯夏莲，何承忠，张志毅，等.植物遗传多样性研究方法概述［J］.西南林学院学报，2006，26(1):69-75.

［38］张传军，刘亦肖，肖娅萍.遗传多样性与植物的遗传标记［J］.陕西师范大学学报:自然科学版，2006，34(S1):275.

［39］梁盛业.金花茶组植物核型的比较［J］.广西林业科学，1995，24(3):143-145.

［40］黄锦培，邹琦丽.金花茶染色体组型的观察［J］.广西植物，1982，2(1):14，15-16.

［41］卢天玲，聊汉刃，董学军.两种金花茶染色体形态的初步研究［J］.广西农学院学报，1986(2):73-76.

［42］廖汉刃，卢天玲，李福富.六种金花茶花粉染色体的观察［J］.广西农学院学报，1988，7(3):39-42.

［43］陈维新，梁盛业，蔡玲.平果金花茶核型的研究［J］.植物研究，1988，8(3):171-175.

［44］廖汉刃，卢天玲，李福富.四种金花茶的核型比较［J］.广西植物，1991，11(2):157-161.

［45］秦新民，高成伟，梁倩华，等.防城金花茶和金花茶的核型比较［J］.广西林业科技，1992，21(1):2-5.

［46］秦新民.金花茶组植物核型特征的初步研究［J］.广西林业科技，1993，22(2):54-60.

［47］王任祥，梁倩华，杨继华，等.毛籽金花茶和龙州金花茶的细胞学研究［J］.广西师范大学学报:自然科学版，1994，12(4):76-80.

［48］梁宇，荆玉祥，沈世华.植物蛋白质组学研究进展［J］.植物生态学报，2004，28(1):114-125.

［49］梁机，杨振德，黄素梅.八种金花茶植物可溶性蛋白质电泳分析及其亲缘关系初探［J］.广西农业大学学报，1998(17):1-5.

［50］伍春莲，孙敏，王颖，等.AFLP分子标记及其在禾本科作物遗传改良中的应用［J］.作物研究，2001(4):48-51.

［51］唐绍清，杜林方，王燕.山茶组金花茶组金花茶系的AFLP分析［J］.武汉植物学研究，2004，22(1):44-48.

［52］宾晓芸.金花茶遗传多样性和居群遗传多样性的ISSR、RAPD和AFLP 分析［D］.桂林:广西师范大学，2002.

［53］杨玉玲，马祥庆，张木清.ISSR分子标记及其在树木遗传育种研究中的应用［J］.亚热带农业研究，2006，2(1):18-24.

［54］宾晓芸，唐绍清，周俊亚.金花茶遗传多样性的ISSR分析［J］.武汉植物学研究，2005，23(1):20-26.

［55］柴胜丰，庄雪影，邹蓉，等.濒危植物毛瓣金花茶遗传多样性的ISSR分析［J］.西北植物学报，2014，34(1):93-98.

［56］肖政，李纪元，李志辉，等.金花茶组物种遗传关系的ISSR分析［J］.林业科学研究，2014，27(1):71-76.

［57］唐绍清，施苏华，钟杨.基于ITS序列探讨山茶属金花茶组的系统发育关系［J］.广西植物，2004，24(6):488-492.

［58］韦霄，韦记青，蒋水元.迁地保护的金花茶遗传多样性评价［J］.广西植物，2005，25(3):215-218.

［59］陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用［J］.安徽农业科学，2007，35(13):3785-3786，3792.

［60］施苏华，唐绍清，陈月琴.11种金花茶植物的RAPD分析及其系统学意义［J］.植物分类学报，1998，36(4):317-322.

［61］唐健民.基于SSR标记的东兴金花茶交配系统分析及其抗旱性研究、东兴金花茶SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选［D］.桂林:广西师范大学，2011.

［62］徐晶，黄连冬，徐颖，等.用SSR分子标记鉴定金花茶杂交种［J］.复旦学报:自然科学版，2009，48(5):668-673，679.