牡丹皮中多糖提取工艺的响应曲面法优化研究

张利霞+常青山+侯小改+侯典云+薛俊鹏+徐凯锋+李亚鸽

摘 要：

为高效提取中药材牡丹皮中的多糖，利用响应曲面法优化回流提取牡丹皮多糖工艺。在单因素试验基础上，以提取温度、提取时间、水料比为响应因子，采用Box-Behnken design方法进行三因子三水平试验，以多糖得率为响应值，进行响应面分析。结果表明：提取温度与提取时间均显著影响牡丹皮多糖提取得率，三因子对多糖提取得率的影响作用大小依次为：提取温度﹥提取时间﹥水料比。牡丹皮多糖提取的最佳工艺条件为提取温度84℃、提取时间1.1 h、水料比31∶1，牡丹皮多糖提取得率预测值为3.732%，验证后得率为3.727%，与预测值基本吻合，相对误差为0.134%。本研究为牡丹皮的精深加工提供理论依据，同时为牡丹皮多糖构效关系的深入研究奠定基础。

关键词：牡丹皮;多糖;响应面分析;优化

中图分类号：S567.1+5  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2015）06-0118-07

Optimization of Extraction Technology of Polysaccharides

from Moutan Cortex via Response Surface Methodology

Zhang Lixia1， Chang Qingshan2*， Hou Xiaogai1， Hou Dianyun1，Xue Junpeng1， Xu Kaifeng1， Li Yage1

（1. College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China;

2. College of Forestry， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

Abstract To efficiently extract polysaccharides from moutan cortex， the response surface methodology was used to optimize the extraction technology. The Box-Behnken design method was used to conduct the 3-factors and 3-levels experiment on the basis of single-factor experiment for the responsive surface analysis. The extraction temperature， extraction time and ratio of water to material were the response factors. The yield of polysaccharides was the response value. The results showed that the yield of polysaccharides were significantly affected by extraction temperature and time. The effects of the 3 factors on polysaccharide yield were in order of extraction temperature，extraction time and ratio of water to material. The optimum extraction conditions were the extraction temperature as 84℃， extraction time of 1.1 hours and ratio of water to material as 31∶1. The predicted value of polysaccharide yield was 3.732% and the verified value was 3.727%. The verified value was basically coincident with the predicted one with the relative error as 0.134%. This study could provide theoretical references for deep processing of moutan cortex and lay the foundation for studying on the structure-function relationship of polysaccharides from moutan cortex.

Key words Moutan cortex; Polysaccharide; Responsive surface analysis; Optimization

牡丹皮为芍药科芍药属多年生植物牡丹 （Paeonia suffruticosa Andrews）的干燥根皮，是我国传统中药材，中医临床应用历史悠久[1]。牡丹皮始载于《神农本草经》，列为中品，其性微寒，味苦、辛，具有清热凉血、活血化瘀的功效，用于治疗热入营血，温毒发斑，夜热早凉，吐血衄血，无汗骨蒸，跌扑伤痛，痈肿疮毒，经闭痛经等症[2]。牡丹皮的有效成分主要为酚及酚苷类、甾醇及其苷类、萜类及其苷类、多糖、黄酮、有机酸、香豆素等;药理实验表明，牡丹皮具有抗肿瘤、调节心血管系统、调节免疫功能、保肝、消炎、抗菌等药理作用。endprint

近年来，植物多糖一直是功能性成分中的研究热点，多糖类物质与维持人体机能的细胞活动关系密切，其作为免疫制剂具有重要作用。已有研究发现：植物多糖具有抑制肿瘤[3]、增强免疫[4，5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、调节心血管系统[8，9]等重要药理作用。近年来牡丹皮多糖的研究日益被重视，彭代银等[10]通过药理实验发现牡丹皮多糖具有很高的安全性;万京华等[11]认为牡丹皮多糖对免疫抑制小鼠具有免疫调节作用;赵帜平等[12]认为丹皮多糖具有降低小鼠血糖作用;杜凡等[13]认为牡丹皮中多糖单用或与丹皮酚、总苷合用均有抑菌作用，牡丹皮多糖开发成新药的利用前景广阔。

影响牡丹皮水溶性多糖提取得率的因素有很多，如提取时间、提取温度、水料比等，但一个因素的影响作用决定于其它因素，若在一定时间内只考虑单个因素的影响作用不仅严重耗时，而且无法检测不同因素间的交互作用[14]。响应曲面法（response surface methodology，RSM）是一种被广泛使用的优化实验条件的统计模型，可以有效减少实验次数、检测不同因素之间的交互作用，并能寻求因素的最佳操作条件[14，15]。本研究以提取温度、提取时间和水料比作为响应因子，以牡丹皮多糖得率为考察指标，在单因素试验基础上，采用响应曲面法（RSM）技术中的Box-Behnken design方法，优化牡丹皮中多糖提取工艺，建立并验证相关数学模型，旨在为科学合理利用牡丹皮多糖资源及牡丹皮多糖构效关系的研究提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

牡丹皮中药材购自洛阳市涧西区健康大药房，经鉴定为芍药科芍药属植物牡丹（P. suffruticosa）的干燥根皮饮片。

试剂：乙醚、丙酮、无水乙醇、乙酸乙酯、硫酸、葡萄糖、蒽酮等均为国产分析纯。

1.2 主要仪器设备

Q-250A3高速多功能粉碎机（上海冰都电器有限公司），HH-W600数显恒温水浴锅（江苏金坛市科析仪器有限公司），H1850R高速冷冻离心机（湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司），FA1204B精密天平（上海精密科学仪器有限公司），752S紫外可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄糖标准曲线的制备 精确称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖37.5 mg，置于250 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配得葡萄糖对照品溶液。精确吸取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，分别加入蒸馏水至 2.0 mL，然后分别再加入2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，立即置于沸水浴中，准确计时15 min后取出，用冷水冷却至室温，静置10 min，同时以蒸馏水2.0 mL加 2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL和浓硫酸5.0 mL作空白，在（624 ±1） nm波长处测定吸光值。以糖含量（μg）为横坐标、吸光度为纵坐标，制得标准曲线：y = 0.0068x - 0.0282，r = 0.9997，糖含量在0.015 ～ 0.105 mg范围内线性关系良好。

1.3.2 牡丹皮多糖的提取与含量测定 将牡丹皮饮片在60℃下鼓风干燥至质量恒定，粉碎，过60目筛，称取约0.5000 g的牡丹皮粉末，置于250 mL烧瓶中，加入乙醚用索氏提取器提取2 h进行脱脂处理。然后挥去溶剂，再加入80%乙醇50 mL，在60℃下回流提取1.0 h进一步除杂，过滤后将残渣用80%乙醇10 mL洗涤2次，再用丙酮洗涤2次，然后改用蒸馏水提取，控制一定条件回流一定时间后在10 000 r/min下离心10 min，共离心3次，将上清液合并，全部置于250 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容，待测。

精密吸取该试液1 mL，加入蒸馏水1 mL，然后分别再加入2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL，立即置于沸水浴中，准确计时15 min后取出，用冷水冷却至室温，静置10 min，同时以2.0 mL蒸馏水加 2%蒽酮-乙酸乙酯溶液0.5 mL和浓硫酸5.0 mL作空白，在（624 ±1） nm波长处测定样品吸光度，计算粗多糖提取得率。

粗多糖提取得率（%）= 糖溶液中多糖的质量/牡丹皮粉末的质量 × 100

1.3.3 牡丹皮多糖回流提取工艺的单因素试验 本研究以提取温度、提取时间和水料比为因素，牡丹皮多糖提取得率为指标进行单因素试验。单因素提取温度：60、70、80、90、100℃;提取时间：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h;水料比：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1。

在进行单因素提取试验时，除考察因素梯度设置外，其它两个因素均设定为中间值，即不同温度提取时，时间和水料比分别设置为1.5 h与30∶1;不同时间和水料比提取时，温度设置为80℃。每个因素每个水平提取3次，取平均值。

单因素提取测定之后，以多糖提取得率为纵坐标，相应考察因素为横坐标，作图。根据单因素试验结果，确定每个因素最佳水平，用于响应面设计交叉试验。

1.3.4 牡丹皮多糖回流提取工艺响应面试验优化设计与数据分析方法 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken design试验设计原理，选取影响牡丹皮多糖提取得率（Y）的3个影响因素：提取温度（X1）、提取时间（X2）、水料比（X3）三因素作为自变量进行组合。自变量水平以-1、0、1来代表，xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，具体试验因素及水平编码见表1，试验设计组合及结果见表2。

表1 Box-Behnken设计因素水平及编码

因素代码编码值真实值水平-101endprint

提取温度（℃）x1X1708090

提取时间（h）x2X20.51.01.5

水料比（mL/g）x3X3203040

利用Design-Expert 8.0软件对牡丹皮多糖提取结果进行回归分析，拟合二次多项式模型方程。根据R2值可以判断多项式模型方程拟合的可靠性，R2值越接近于1，多项式模型方程与实际拟合的可靠性就越高。F值检验模型统计学显著性，F值越大说明该自变量对因变量的影响作用越显著;模型系数的概率P值检验因素的线性效应、平方效应及其交互效应的显著性，P值越小，则相应自变量的显著性越高，P<0.05时影响显著，P<0.01时影响极显著[16]。

表2 多糖提取工艺条件的优化试验设计及结果

实验号x1x2x3多糖得率 （%）

1-1-102.192

21-103.250

3-1102.353

41103.328

5-10-12.285

610-13.039

7-1011.825

81013.389

90-1-13.237

1001-13.382

110-113.191

120113.216

130003.626

140003.580

150003.597

160003.684

170003.645

2 结果与分析

2.1 单因素对牡丹皮多糖得率影响研究

2.1.1 提取温度对牡丹皮多糖得率的影响 设定提取时间为1.0 h、水料比为30∶1条件下，以提取温度对牡丹皮多糖提取得率进行单因素试验。从图1可以看出，在温度低于80℃时，多糖提取得率随着温度的升高而逐渐增加，且增幅明显，在80℃时达到最大值，之后逐渐下降。这种现象可能是由于温度过高使牡丹皮多糖的结构被破坏，从而导致提取得率下降。因此，提取温度选择在80℃左右为宜。

图1 提取温度对多糖得率的影响

2.1.2  提取时间对牡丹皮多糖得率的影响 设定提取温度为80℃、水料比为30∶1条件下，以提取时间对牡丹皮多糖得率进行单因素试验。从图2可以看出，牡丹皮多糖提取得率随着时间的延长呈先上升后下降的趋势，在1.0 h达到最大值。由此说明，利用回流方法提取牡丹皮多糖时，时间不宜过久，否则多糖结构亦会遭到破坏，从而使多糖得率降低。因此，提取时间选择在1.0 h左右为宜。

图2 提取时间对多糖得率的影响

2.1.3 水料比对牡丹皮多糖得率的影响  设定提取温度为80℃、提取时间为1.0 h条件下，以水料比对牡丹皮多糖提取得率进行单因素试验。从图3结果可以看出，在水料比小于30∶1时，多糖得率增加趋势明显，在水料比为30∶1时，多糖得率达到最大值，之后呈缓慢下降趋势。因此，选择水料比在30∶1左右为宜。

图3 水料比对多糖得率的影响

2.2 响应曲面法优化牡丹皮多糖提取工艺

2.2.1 响应面分析结果 通过Design-Expert 8.0 软件对各因素进行回归拟合，得到以下多元二次回归方程：多糖得率Y（%）=-46.08910+1.17185X1+1.50510X2-5.21139×10-3X3-4.12000×10-3X1+2.02574×10-3X1X3-6.01831×10-3X2X3-7.33820×10-3X12-0.44621X22-2.58071×10-3X32

对牡丹皮多糖提取工艺进行响应面分析，结果（表3、表4）表明，模型的F值为221.20，且模型显著性检验P<0.01，表明该模型是极显著的，具有统计学意义。失拟值为2.40，失拟项P值为0.2080>0.05，表明失拟和纯误差相关不显著，无失拟因素存在。模型的决定系数R2=0.9965，校正决定系数R2（adj） = 0.9920 > 0.80，变异系数（CV）为1.665%，说明该模型拟合度较好，响应值（多糖提取得率）的变化有99.65%来自于所选的变量，即提取温度、提取时间和水料比。进一步说明得到的牡丹皮多糖提取得率二次回归模型对实际拟合情况较好，可用该回归方程对牡丹皮多糖提取工艺研究进行初步分析和预测。

由表4可知，模型的自变量一次项X1，二次项X1X3、X1X1、X2X2、X3X3达极显著水平（P<0.01）;一次项X2呈显著水平（P<0.05）。同时，根据F值的大小顺序，可以推断在选择的实验范围内，三个因素对多糖提取得率的影响作用不同，作用大小排序为：提取温度（X1）>提取时间（X2）>水料比（X3），其中提取温度对牡丹皮多糖提取得率的影响作用达到极显著水平（P<0.01），提取时间对牡丹皮多糖提取得率的影响作用达到显著水平（P<0.05），而水料比的影响作用不显著（P>0.05）。

表3 多糖提取拟合多元二次模型差异分析

标准偏差平均值变异系数

（%）决定系数校正决定

系数预测决定

系数信噪比

0.0523.1071.6650.99650.99200.962044.830

表4 方差分析结果

方差来源 平方和自由度均方 MSF值 P值（Prob >F）显著性

模型5.3300 90.5900 221.20 < 0.0001**

X12.3700 12.3700 884.40 < 0.0001**endprint

X2 0.0210 10.0210 7.81 0.0267*

X30.0130 10.0130 4.84 0.0637

X1X20.0017 10.0017 0.64 0.4488

X1X3 0.1600 10.1600 61.30 0.0001**

X2X30.0036 10.0036 1.35 0.2841

X1X12.2700 12.2700 847.39 < 0.0001**

X2X20.0530 10.0530 19.68 0.0030 **

X3X30.2800 10.2800 104.81 < 0.0001**

残差0.0190 70.0027 --

失拟0.0120 30.0040 2.40 0.2080

纯误差0.0067 40.0017 --

总差5.3500 16---

注：**表示差异极显著（P<0.01），*表示差异显著（P<0.05）。

2.2.2 因素间的交互影响 根据回归方程得到牡丹皮多糖提取不同因素的响应面分析三维图及相应等高线图（图4～图6），可清晰、直观地看出响应曲面的最高点，参数范围内的极值与不同因素间的交互作用对响应值的影响作用，据此能够确定最佳工艺条件范围。

图4 Y=f（X1，X2）的三维响应图与等高线图

图5 Y=f（X1，X3）的三维响应图与等高线图

图6 Y=f（X2，X3）的三维响应图与等高线图

图4为水料比为30∶1时不同提取温度和提取时间对牡丹皮多糖提取得率的影响，从图中可知，提取温度在85℃左右，提取时间在1.0 h左右，牡丹皮多糖提取得率达到最大值。图5为提取时间为1.0 h时不同提取温度和水料比对牡丹皮多糖提取得率的影响，从图中可知，提取温度在80℃左右，水料比为30 mL/g左右，牡丹皮多糖提取得率达到最大值。图6为提取温度为80℃时，不同提取时间与水料比对牡丹皮多糖提取得率的影响，从图中可以看出提取时间在1.0 h左右，水料比在30 mL/g左右，牡丹皮多糖提取得率达到最大值。

对多元二次回归模型（1）求解方程，提取牡丹皮多糖的最佳工艺条件为提取温度83.77℃、提取时间1.09 h、水料比30.60∶1，由拟合模型预测牡丹皮多糖最大提取得率为3.732%。为达到提高效率与节省能耗并取得最佳效果的目的，同时考虑到实际操作的可行性，将牡丹皮多糖的提取工艺条件修正为：提取温度84℃、提取时间1.1 h、水料比31∶1。

采用上述最佳工艺提取牡丹皮多糖（n = 4）以验证响应面的可行性。结果显示，实际平均提取得率为3.727%，与理论预测值3.732%基本吻合，比单因素平均提取率高22.82%。

3 讨论

多糖是构成生命的天然大分子之一，是由单糖通过糖苷键连接而成的高分子聚合物，其结构复杂，种类多样，在提取时若温度过高或提取时间过长，多糖易发生分解或结构受到破坏。本研究在单因素试验中，提取温度在达到80℃、提取时间达到1.0 h之后，牡丹皮多糖提取得率均出现下降趋势，尤其是温度达到90℃之后，多糖提取得率迅速下降，说明高温可能会影响牡丹皮多糖的结构和活性，使其发生分解，这与房海灵等[17]研究结果一致。在热回流提取牡丹皮多糖的过程中，提取温度是影响多糖提取得率的最关键因素。孟宪军等[18]研究发现提取五味子多糖最优提取时间为5 h，Shao等[19]研究发现提取三叶青根中多糖最优提取时间为1.55 h，而本研究中提取牡丹皮多糖最优提取时间为1.1 h，比文献报道的提取时间较短，这可能与植物材料种类、多糖构成及其含量多少有关，植物器官中多糖含量越高，相应的提取时间可能会被延长。

植物多糖的提取方法有多种，例如：溶剂提取法、酶提法、超声提取法、微波提取法等，但不同方法各有优劣，溶剂提取法作为常用方法之一，具有成本低、不需特殊设备等优点，在实际生产中应用广泛。Shao等[19]利用响应曲面法优化提取三叶青根中多糖，测得多糖提取得率为5.182%;于爱红[20]利用正交试验优化毛茛科植物大火草根多糖热回流提取工艺，多糖提取得率为5.916%;刘玉芬等[21]利用响应曲面法优化马兰头多糖提取工艺，在最佳提取条件下测得马兰头不同部位多糖含量，叶为4.941%，茎为1.536%，根为0.682%，为其植物资源的有效开发利用奠定基础。研究表明，不同产地、采收期、加工方法等因素均会影响丹皮多糖得率，因此，若以多糖含量与多糖提取得率共为指标来衡量试验结果，则能更加准确、全面地考查相关试验因素的影响作用[22]。4 结论

响应曲面法可应用于优化牡丹皮多糖提取工艺。本研究在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken method对牡丹皮多糖提取工艺进行优化，并根据统计学结果对模型进行显著性检验，探讨各因素间的交互作用，优化内在单因素水平，并对试验结果进行模拟、预测，最终以最经济的方式准确、高效地得到优化条件。

通过回归模型及方程优化得到牡丹皮多糖提取的最佳条件为：提取温度84℃，提取时间1.1 h，水料比为31∶1，此条件下牡丹皮多糖平均提取得率为3.727%。回归分析与验证试验结果表明，采用响应曲面法优化牡丹皮多糖的提取工艺条件，得到的多糖提取工艺流程能够提高效率并使多糖得率最大化。该研究结果对于牡丹皮多糖构效关系的研究具有重要意义，为牡丹皮多糖的精深加工和新药开发奠定基础，具有一定的理论和实际应用价值。

参 考 文 献：

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