一株产PHB固氮菌的筛选和初步鉴定

李贵正+涂国全+刘纪臣+李新柱

摘 要：经Ashby培养基富集培养及平板分离，从金正大污水处理厂的活性污泥中分离到8株自生固氮菌。经苏丹黑染色初筛获得3株产PHB菌株。以菌株产生的PHB颗粒大小、PHB占细胞干重的含量及菌落生长速度为指标，获得最佳菌株N1。通过《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版初步鉴定此菌株为圆褐固氮菌（Azotobacter  chroococcum）。

关键词：固氮菌;PHB;初筛;复筛;圆褐固氮菌

中图分类号：Q939.11+3  文献标识号：A  文章编号：1001-4942（2015）06-0049-03

Screening and Preliminary Identification for a Strain of

Nitrogen-Fixing Bacterium Producing PHB

Li Guizheng1， Tu Guoquan2， Liu Jichen1， Li Xinzhu1

（1.Kingenta Ecological Engineering Group Co.， Ltd.， Linshu 276700， China;

2. Department of Bioscience and Bioengineering， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045，China）

Abstract Eight nitrogen-fixing bacteria were isolated from  the activated sludge from sewage farm of Kingenta by enriching culture and isolating in Ashby medium. Three strains producing PHB were obtained by Suda black staining. Strain N1 was regarded as the best one by the PHB diameter， content of PHB account for cell dry weight and the colony growth rate. Strain N1 was preliminary identified as Azotobacter chroococcum.

Key words Azotobacter;PHB; Preliminary screening; Secondary  screening; Azotobacter chroococcum

随着人们环保意识的日益提高，研究可降解塑料成了当务之急，寻找可降解的替代品势在必行。聚β-羟基丁酸（poly - β-hydroxybutyric acid ， PHB） 是一种生物可降解的热塑性塑料，其分解产物可完全降解为二氧化碳和水，对环境无任何污染。利用这一特性，世界各国都竞相开发在医学领域、无环境污染塑料制品等方面的用途，主要是人体可吸收医用材料、缓控释微球或微胶囊、一次性塑料制品等[1～3]。我国实行禁塑令之后，作为化工塑料的替代品将会帮助我国解决目前日益严重的“白色污染”问题，应用前景广阔。

产生PHB的细菌包括光能自养、化能自养和异养菌约65属300多种。目前用于PHB研究和生产的菌种主要有真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）、肥大产碱杆菌（Alcaligenes latus）、自养黄杆菌（Xanthobacter autotrophicus）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）、棕色固氮菌（Azotobacter vinelandii）、拜氏固氮菌（A. beijerinckii）、极端嗜盐菌（Haloferax mediterranei）、球形红杆菌（Rhodobacter sphaeroides）以及豚鼠气单胞菌（Aeromanas caviae）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas. putida）、扭脱原单胞菌（Protomonas ectorguens）、红色红球菌（Rhodococcus ruber）等[4]。其中PHB自然累积量比较多的细菌有：产碱杆菌属（Alcaligenes）、假单胞菌属（Pseudomonas）、甲基营养菌（Methylotrophs）、固氮菌属（Azotobaeter）、红螺属（Rhodospillum）。真养产碱杆菌和固氮菌属是研究和应用较多的PHB生产菌种。董兆麟和黄建新[5]从野外采回土样进行菌种分离，得到一株编号为B8的菌株，经初步鉴定为固氮菌，菌株产PHB的量达细胞干重的41.5%。本试验从活性污泥中分离、纯化、筛选出一株高产PHB的固氮菌，以期为利用廉价材料进行发酵、探索普适化生产PHB的途径提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 金正大污水处理厂采集的活性污泥。

1.1.2 培养基 富集培养用Ashby液体培养基，分离培养用Ashby固体培养基（加2%琼脂）。Ashby培养基配方：甘露醇1.0 g， KH2PO4 0.02 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.02 g，CaSO4·H2O 0.02 g，CaCO3 0.5 g，蒸馏水 100 mL，pH 7.0～7.2;0.05 Mpa压力，113℃，灭菌30 min。

1.1.3 主要药品和试剂 苏丹黑，番红，NaClO，二甲苯，丙酮，乙醇，氯仿，十二烷基磺酸钠（SDS）。

1.1.4 主要仪器 显微镜，学生直尺，目镜测微尺，镜台测微尺，G25摇床（USA），电子分析天平（瑞士梅特勒托利多），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 自生固氮菌的获得 ①富集培养方法：Ashby无氮培养液50 mL装于250 mL三角瓶中，灭菌后接种活性污泥一环，100～150 r/min摇床培养，37℃培养48 h[6～7]。静止培养1～2 h，取5 mL上清液接种到灭菌的Ashby液体培养基中，100～150 r/min摇床培养，37℃培养48 h。以上操作步骤重复3次。

②纯化分离方法：采用涂布法获得单菌落，然后采用平板划线法进一步纯化。重复操作直至获得纯培养。

③菌株纯度鉴定方法：37℃培养48 h，平板上不出现杂菌菌落;菌株在平板上形成均具特征性的单菌落;镜检无异样细胞发现。

1.2.2 产PHB固氮菌初筛 苏丹黑染色法判断菌株是否产生PHB。菌体涂片，风干，热固定;用0.3%苏丹黑染色5～15 min，倒去染液，风干;二甲苯浸泡10 s，轻洗玻片数次直至液体不再脱色，风干;番红染色10 s，清洗、风干。根据染色结果判断，PHB颗粒呈蓝黑色，细胞质为红色。

1.2.3 产PHB固氮菌复筛 经初筛的产PHB固氮菌株37℃培养48 h，测定PHB颗粒直径、菌落直径，培养60 h时测定PHB占细胞干重的百分比，进行复筛。

①PHB颗粒大小测定：显微镜下用目镜测微尺进行测量并计算。

②菌落大小测定：采用“十”字交叉法测量同一菌落直径2次，取平均值。

③PHB含量测定： 取200 mL发酵液，4 000 r/min离心 20 min，菌体用蒸馏水洗涤后再离心。离心后的菌体悬浮于42.5 mL蒸馏水中，加入10 mL 100 g/L的SDS，在水浴中搅拌处理10 min，然后再加入5 mL NaClO溶液，继续搅拌处理5 min。处理后的菌液4 000 r/min离心20 min，沉淀物用蒸馏水和丙酮各洗涤一次， 60～70℃下烘干。干品用15 mL氯仿60℃抽提60 min，然后过滤。滤液加热蒸发，除去氯仿，析出PHB。再用丙酮和乙醇各洗涤一次，60℃烘干，得到白色粉末或薄膜状PHB[8～11]。采用Lemoigue 重量分析法[12]测定PHB占细胞干重的百分比。

1.2.4 菌株鉴定法 通过观察细胞形态、菌落培养特征、荚膜有无、革兰氏染色等，参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 富集培养后分离纯化结果

获得自生固氮菌株8株，7株为球菌，1株为短杆菌。

2.2 初筛结果

苏丹黑染色鉴定3株球菌产生PHB，分别命名为菌株N1、菌株N2和菌株N3，见图1。

图1 PHB染色结果（10×100）

2.3 复筛结果

3株固氮菌株培养48 h产PHB颗粒大小、菌落直径大小及培养60 h后产PHB含量均为菌株N1最大，菌株N2次之，菌株N3最小，菌株N1被确定为最佳菌株。

表1 3株固氮菌产PHB颗粒直径、菌落

直径及PHB含量

菌株

编号 产PHB颗粒

直径（μm） 菌落直径

（cm） PHB占细胞干重

百分比（%）

N1 1.8 2.8 37.3

N2 1.5 2.1 34.9

N3 1.3 1.9 28.4

2.4 菌株N1初步鉴定结果

2.4.1 细胞显微镜下观察结果 在显微镜下细胞呈大卵圆形，培养2 d后，常成对出现，呈“8”字型排列，菌体直径约为2～5 μm。

2.4.2 菌落培养特征 Ashby无氮平板培养基培养2 d后，菌落直径约0.88～1.66 cm，菌落由白色逐渐变为褐色;30 h后菌落颜色逐渐变成黄褐色;菌落表面比较湿润，菌体边缘近似椭圆形，表面隆起呈花纹状，不透明（图2）。

注：96 h菌落为放大1.5倍。

图2 自生固氮菌36、96 h菌落

2.4.3 荚膜染色结果 菌株N1荚膜负染色结果如图3，可见具较厚的荚膜层。

2.4.4 革兰氏染色结果 革兰氏染色后菌株N1菌体呈红色，为革兰氏阴性菌。

2.4.5 菌株鉴定结果 参照《伯杰氏细菌学鉴定手册》第九版对菌株进行形态特征、生理生化特征等方面的鉴定，初步鉴定该菌为圆褐固氮菌（Azotobacter  chroococcum）。

图3 荚膜染色（10×40）

3 小结与讨论

3.1 本试验将分离纯化与高产PHB菌株的筛选结合起来，以菌株所产PHB颗粒大小、菌落生长速度和所产PHB占细胞干重含量为指标进行复筛，选出了最佳菌株N1。

3.2 高产PHB菌株N1的初步研究表明：该菌生长速度快，产生的PHB颗粒几乎达到菌体体积的2/3，含量可达菌体干重的37%以上。如经诱变和培养基优化，可成为极有前途的生产菌种，具有较大的应用价值。

3.3 经过生物学特征研究后，初步鉴定此菌株为圆褐固氮菌（Azotobacter  chroococcum）。

参 考 文 献：

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