纳米银凝胶无菌检查的直接接种法及对抑菌成分的干扰排除效果

崔晓博，刘旭，马守栋，李明春

纳米银凝胶无菌检查的直接接种法及对抑菌成分的干扰排除效果

崔晓博，刘旭，马守栋，李明春＊

无菌检查；纳米银凝胶；直接接种法

纳米银［1，2］由于体积及其微小，表面活性位置多，穿透力强，易于进入多种病原体的内部，从而达到破坏病原体，促进伤口愈合的作用。纳米银对细菌、真菌等都具有较强而持久的抑制作用，且不易产生耐药。纳米银凝胶是笔者所在医院开发研制的新剂型，由硝酸银和卡波姆组成，主要用于治疗烧烫伤，控制创面感染。《中国药典》2010版二部附录凝胶药项下规定用于烧伤或严重创伤的凝胶药，经无菌检查法［3］检查，应符合规定。此凝胶中含有大量赋形剂等高分子物质［4］，这些物质不易通过过滤膜，因此本品不宜采用薄膜过滤法，其无菌检查应选用直接接种法，同时去除其抑菌成分对无菌检查的干扰。

1　材料与方法

1.1仪器电热恒温水箱；SW-CJ-1F单人双面净化台；隔水式电热恒温培养箱；生化培养箱。

1.2培养基硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠培养基，无菌蛋白胨水溶液，0.9%无菌氯化钠溶液。

1.3菌种实验菌株为白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］，金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］，生孢梭菌［CMCC（B）64941］，大肠埃希菌［CMCC（B）44102］，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.4供试品纳米银凝胶（20 g/支，批号：20140310、20140311、20140312）

2　验证方法

2.1菌液的制备接种金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，枯草杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24 h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48 h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数＜100 cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含孢子数＜100 cfu的孢子悬液［4］。菌数的计算应用平板法，结果见表1。

表1　菌液培养结果

2.2培养基的灵敏度检查取9支每管装量为12 ml的硫乙醇酸盐流体培养基，分别接种＜100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3 d；取每管装量为9 ml的改良马丁培养基5支，分别接种＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接种作为空白对照，培养5 d。逐日观察，培养的3～5 d中，空白对照管无菌生长，加入菌液管中细菌生长良好，判定该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的灵敏度检查符合规定。

2.3培养基的无菌性检查取两种培养基各5瓶，分别放置在各自的培养温度下空白培养14 d，空白培养管均无菌生长。判该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的无菌性检查符合规定。

2.4供试品溶液的制备取纳米银凝胶供试品4支（批号20140310），全部加至400 ml无菌氯化钠蛋白胨中，搅拌使其完全溶解，作为供试品溶液。

2.5方法验证试验

2.5.1验证方法一取硫乙醇酸盐流体培养基8瓶（100 ml/瓶），分别接种＜100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌、生孢梭菌各2瓶，取改良马丁培养基4瓶，分别接入＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各两瓶，其中一瓶接入供试品10 ml，另一瓶做对照。结果见表2。

2.5.2验证方法二硫乙醇酸盐流体培养基的用量改为150 ml/瓶，其他操作同方法一，结果见表3。

2.5.3验证方法三硫乙醇酸盐流体培养基的用量改为200 ml/瓶，其他操作同方法一，结果见表4。

3　无菌检查

取3批样品，供试品的制备同验证试验，每批供试品取硫乙醇酸盐流体培养基4瓶，其中两瓶接入供试品10 ml，置30～35℃培养；一瓶接入无菌氯化钠蛋白胨10 ml，置30～35℃培养，作为阴性对照；一瓶接入供试品10 ml和＜100 cfu的金黄色葡萄球菌1 ml［5］，置30～35℃培养，为阳性对照。取改良马丁培养基3瓶，两瓶接入供试品10 ml，置30～35℃培养；一瓶接入无菌氯化钠蛋白胨10 ml，置30～35℃培养，作为阴性对照。

表2　验证试验结果（方法一）

表3　验证试验结果（方法二）

表4　验证试验结果（方法三）

4　结果

方法验证结果见表2、3、4。三批供试品及阴性对照组培养14 d均未有菌生长，阳性对照组培养3 d，细菌生长良好。

5　讨论

薄膜过滤法是检查含抗菌成分药物的一般方法，但纳米银凝胶中含大量的卡波姆，不易通过过滤膜，因此采用直接接种法对其进行检查。但纳米银具有抑菌作用，在验证方法一中，供试品组中细菌的生长相较于阳性对照组明显较弱，说明纳米银对细菌的生长有抑制作用；在验证方法二中，加大培养基的用量，减弱了纳米银凝胶的抑菌作用，但供试品组的细菌生长仍弱于阳性对照组；方法三中，继续加大培养基的用量，每天进行密切观察发现供试品组的细菌长势与阳性对照组的细菌长势基本相同，说明此方法中培养基用量可完全去除纳米银凝胶的抑菌作用。

所以在纳米银凝胶的无菌检查中，笔者采用直接接种法并加大培养基的用量去除其抑菌作用以达到良好的效果。【参考文献】

［1］施畅，徐丽明，邵安良.纳米银的毒理学研究现状［J］.药物分析杂志，2013，33（12）：2025-2033.

［2］孙倩，李明春，马守栋.纳米银抗菌活性及生物安全性研究进展［J］.药学研究，2013，32（2）：103-105.

［3］中华人民共和国药典［S］.二部.2010版：附录.

［4］丁有学，刘兰，毕华，等.碱性成纤维细胞生长因子凝胶的无菌检查［J］.中国药事，2013，27（9）：932-934.

［5］江志杰，刘文杰，高春，等.左氧氟沙星注射液无菌检查方法验证［J］.中国药品标准，2008，9（4）：245-247. ［2015-03-08收稿，2015-04-07修回］

［本文编辑：吴蓉］

R318.08

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李明春，Email：lmc401y@163.com