滤纸干血片法筛查孕中期唐氏综合征的可行性研究

刘清银，李娅妮，涂斌，周玉杰，胡晓丹，刘小庆

滤纸干血片法筛查孕中期唐氏综合征的可行性研究

刘清银，李娅妮＊，涂斌，周玉杰，胡晓丹，刘小庆

目的探讨对滤纸干血片洗脱液中血清甲胎蛋白（AFP）和游离β-人绒毛膜促性腺激素（游离βhCG）的含量检测，应用于孕中期妇女唐氏（Down’s）综合征产前筛查的可行性。方法应用自动微粒子化学发光法（CLEIA）检测1260例孕妇滤纸干血片法标本中AFP与游离β-hCG的含量与常规血清法所测含量比较。结果干血片法检测AFP含量的变异度为2.1%～6.5%；回收率为96.2%；灵敏度为0.5 ng/ml；游离β-hCG含量的变异度为3.9%～6.7%；回收率为98.4%；灵敏度为0.5 ng/ml；该研究共74例为阳性，阳性率为5.9%，其中1例已确诊为唐氏综合征胎儿，与血清学筛查结果的符合率为98.89%。结论采用滤纸干血片法替代血清学方法测定孕中期女性血中AFP和游离β-hCG的含量，用血少，成本较低，方便快捷，筛查结果准确可靠。

滤纸干血片；唐氏综合征；甲胎蛋白；游离β-人绒毛膜促性腺激素

检测孕妇血清中的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）、游离β-人绒毛膜促性腺激素（free betahuman chorionic gonadotropin，游离β-hCG）两种生化标志物作为孕中期唐氏综合征筛查已开展多年［1］。但抽取静脉血的标本不易保存（国家要求唐氏综合征筛查标本保留2年）、运送具有潜在生物安全隐患等问题，影响了唐氏综合征产前筛查的大规模展开。

滤纸是血液的极好载体。制作滤纸干血片方法简单、需血量少、保存运输方便等优点，已在新生儿疾病筛查中广泛应用［2］。该研究将滤纸血片应用于唐氏综合征产前筛查，采用自动微粒子化学发光法（CLEIA）检测孕中期滤纸干血片洗脱液中AFP、βhCG的含量，旨在探讨滤纸干血片法替代血清学方法的可靠性和可行性。

1　资料与方法

1.1一般资料所有滤纸血片标本均于2008年3月—2013年6月采集自妊娠15～20孕周的单胎孕妇，共1260例，均来自于解放军第150中心医院就诊病例。孕妇年龄21～39岁，平均29岁。确切孕周的确定，按末次月经计算月经正常（26～30 d/次）者，有疑问者通过B超确定孕周，所有参加该研究的孕妇均获得知情同意。

1.2方法

1.2.1滤纸干血片的制备参考新生儿疾病筛查滤纸干血片的制备［1］。手指采血或静脉采血时捎带取2滴静脉血，垂直滴加1～2滴（50～100 μl）于滤纸上，滤纸血片直径＞8 mm，自然干燥，4℃保存备用。1.2.2仪器与试剂DXI800微粒子化学发光分析仪、血清AFP及β-hCG联合检测试剂盒均购自贝克曼公司，质控液购自伯乐公司，3～6 mm打孔钳，美国产S&S 903特种滤纸。

1.2.3血片中AFP及游离β-hCG的检测用打孔器在滤纸干血片上打下直径6 mm血片2片，放入干净试管中，加入0.2 μl缓冲液，快速震荡1 h。仪器上设置标准液位置及实验项目，取6支样品杯分别加入190 μl标准液放置仪器上进行定标，设置质控液和样本的编号及项目内容，在样品杯中加入190 μl血片洗脱液、190 μl质控液。放置仪器上进行自动检测。

1.2.4滤纸干血片方法的可行性评估

1.2.4.1精密度分别从15、17、20孕周的孕妇样本中随机各抽取1份滤纸干血片样本，每份样本重复12次，观察每批日间变异。每天对这3份样本进行常规检测，连续20 d，观察日内变异。

1.2.4.2回收率取1份滤纸干血片浸出液标本，定值后分别加入AFP或β-hCG试剂盒中不同浓度的标准品，进行批试验，每份标本重复测3次，求取均值。分别统计分析回收率。回收率=（回收量/加入量）×100%。

1.2.4.3滤纸干血片与血清中浓度的相关性采用两种不同的方法检测AFP及β-hCG含量后，对结果做相关性分析。

1.2.4.4灵敏度为可检测的最低检测下限。采用正常男性血片（血液中AFP及β-hCG水平分别小于0.5 ng/L及0.5 mIu/ml）作为空白样本，重复检测空白及不同低浓度样品20次，当某低浓度样品的平均值-2SD低浓度样品刚好大于空白样品的平均值+2SD空白时，这一低浓度即为该方法的灵敏度［2］。1.2.4.5稳定性随机抽取了5例保存于2～8℃、-20℃以下，1周、2周、1个月及2个月的滤纸干血片标本，测定其AFP及β-hCG含量，并与采血当日的结果相比较（重复测定20次）。

1.2.4.6末梢血片与静脉血片的相关性在常规实验的条件下，分别测定20位孕中期妇女的两种血片中AFP及β-hCG的水平，并对结果做相关回归分析。

1.2.4.7红细胞压积的不同对血片中AFP及βhCG水平的影响抽取三组各孕周构成比相同但红细胞压积不同的干血片标本（红细胞压积分别为≤0.3，0.3～0.4和＞0.4）。采用单因素方差分析，对三组AFP及β-hCG测定结果进行比较分析。

1.2.51260例孕妇血片与血清筛查结果的比较血片标本由中国人民解放军第150中心医院检验科采集制作，采用所建立的滤纸干血片检测方法进行血片中AFP及β-hCG水平的检测工作。采用全自动微粒子发光仪，严格遵照SOP标准程序进行操作，通过配套筛查软件对Down’s综合征发病风险进行评估，并与血清筛查结果相比较。同时评价分析两种筛查方法的经济成本。

1.3统计学处理以SPSS13.0对计量资料、计数资料进行统计分析。计量资料以x±s表示，采用t检验进行两样本比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1精密度以批内及日间变异系数（CV）评价β-hCG及AFP的精密度，β-hCG、AFP的批内、日间CV均＜10%，说明本法重复性好、精确度高。见表1、2。

表1　滤纸干血片法测定AFP、游离β-hCG的批内变异（n=12）

表2　滤纸干血片法测定AFP、游离β-hCG的日间变异（n=20）

2.2回收率滤纸干血片法测定AFP及β-hCG的回收率为91.1%～101.6%和96.4%～99.5%。见表3。

2.3血清与血片中浓度的相关性血清与血片中AFP浓度呈高度相关，Pearson相关系数为0.986 （P＜0.001）；血清与血片中β-hCG浓度呈高度相关，Pearson相关系数为0.991（P＜0.001）。

2.4灵敏度β-hCG的最低检测限为0.5 ng/ml，其重复检测20次的微粒子发光读数平均值2.6 （1673.8）-2SD（SD=128.1）＞空白平均值（1287.2）+ 2SD（SD=63.8）。AFP的最低检测限为0.5 ng/ml，其重复检测20次的微粒子发光读数平均值（1700.8）-2SD（SD=132.3）＞空白平均值（1237）+2SD（SD= 70.7）。

2.5稳定性5例保存于2～8℃、-20℃以下，1周、2周、1个月及2个月滤纸干血片标本的结果，与采血当日之结果相比较（重复测定20次），日间CV均在+3SD之内，因此不同的保存温度和保存时间的浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、5。

表3　滤纸干血片法测定AFP、游离β-hCG的标本回收率

表4　滤纸干血片法测定AFP的日间变异（x±s，μg/ml）

表5　滤纸干血片法测定游离β-hCG的日间变异（x±s，ng/ml）

2.6静脉血片与末梢血片浓度的相关性通过相关回归分析显示，两种血片中的AFP及β-hCG值相关系数r分别0.992及0.991，两种血片之间AFP 及β-hCG水平的差异无统计学意义。

2.7红细胞压积的不同对血片中AFP及β-hCG水平的影响采用单因素方差分析，对三组AFP及β-hCG测定结果进行比较分析，不同的红细胞压积对AFP和β-hCG浓度的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。

表6　不同红细胞压积（Hct）的干血片标本中AFP、游离β-hCG含量的比较

2.81260例孕妇血片与血清筛查结果的比较采用血片法对1260例孕妇进行唐氏综合征筛查，敏感度=66/（66+2）=97.1%，特异度=1230/（1230+16）= 99.0%，准确度=（69+1230）/1320=98.9%。依据以上指标，认为血片法测定孕妇AFP、β-hCG的水平，筛查唐氏综合征灵敏度高、特异性强，成本低廉。

2.9滤纸干血片法的准确度为评价滤纸干片法的准确度，将1260例孕妇血片与血清筛查结果进行比较，前者阳性率为5.9%（74/1260），后者的阳性率为5.4%（68/1260），其中1例得以确诊，筛查阳性率的差异无统计学意义（χ2=0.925，P＞0.05），见表7。

表7　滤纸干血片法与血清法唐氏综合征筛查结果的比较

3　讨论

微粒子化学发光方法（CLEIA），采用金钢烷（AMPPD）标记抗原或抗体，在碱性磷酸酶作用下得到一个中等稳定的中间体AMPD（半衰期2～30 min）。此中间体分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子，当其回到基态时产生470 nm的光，并可持续几十分钟，用化学发光的检测技术检测光子的量，计算出物质的相应浓度。极大地提高了分析的灵敏度、特异性、重复性、线性范围，抗干扰能力、自动化程度及检测速度，是目前国内外检测血清微量标记物常用的生物学技术。目前我国也逐步采用了微粒子发光这一先进技术，测定血清中AFP及游离β-hCG的含量，用于孕中期唐氏综合征筛查，在一定程度上有取代ELISA的趋势。

血片法最早在1963年由Guthrle等人首次用于代谢性疾病的大规模筛查，进而应用于新生儿疾病的筛查［3］。滤纸干血片标本生物安全性高，具有标本运送安全、方便快捷且不增加筛查成本等优点，更适合大规模筛查工作的开展。在以滤纸干血片为载体的标志物检测方面，微粒子化学发光方法已用于测定血清中微量甲状腺激素、苯丙酮含量［2］。目前，还鲜见运用微粒子化学发光方法滤纸干血片联合检测AFP及游离β-hCG的报道。因此，采用微粒子化学发光法比较分析滤纸干血片法与血清法的检测效果，评价以滤纸干血片为载体的检测方法在孕中期唐氏综合征筛查中的应用价值，具有重要的意义。

该研究在国内较早以滤纸干血片作为载体［4］，采用微粒子化学发光方法检测人血AFP及游离βhCG的水平，用于孕中期唐氏综合征的筛查。首先评价了滤纸干血片法技术上的可行性。通过比较采用微粒子发光法分别检测滤纸干血片及血清中的AFP及β-hCG含量的变异度、回收率、分析灵敏度，结果表明差异无统计学意义，符合美国CLIA’88规定的质量要求标准。其次，评价了滤纸干血片法在保存方面的优势。国外已有报道显示AFP和游离β-HCG血片在4℃时可保存60 d［5］，这样便避免了筛查单位必需配备-20℃冰箱的要求，减少了筛查成本。不同红细胞压积对血片中分析物浓度的影响也成为血片法能否代替血清法的一个重要因素。该研究对1260个标本中随机抽取三组不同红细胞压积的标本，进行了AFP及游离β-hCG含量的对比测定，经统计学处理，结果较为一致。国内少见采用微粒子发光法检测干血片标本中AFP及游离βhCG，以及研究不同的红细胞压积对干血片标本唐氏综合征筛查结果影响的报道。然后，对末梢血滤纸干血片与静脉血滤纸干血片中AFP及游离βhCG浓度是否有明显变化做了对比分析。结果显示血片与血清中AFP和β-hCG含量无明显差异，因此在制作血片时，可以根据筛查对象的意向，选择用静脉血或末梢血制作滤纸干血片标本。最后，评价了该方法对孕中期唐氏综合征的筛查的临床意义。孕周中位数值的计算受样本量大小的影响，进而影响筛查的阳性率。该次研究结果显示，当切值定为1/270时，滤纸干血片法测定AFP及游离βhCG筛查Down’s综合征的阳性率为6.2%，稍高于金标准——血清筛查阳性率5.4%，经统计学分析处理，两者无明显差异。血片和血清筛查结果与国际公认的金标准血清学筛查结果的符合率为98.9%，表明血片法可以代替血清法用于Down’s综合征的产前筛查。

总之，采用微粒子发光方法检测以滤纸干血片为载体的AFP及游离β-hCG的含量，具有检测效率高以及样品采集、运输、保存方便等优势，对孕中期Down’s综合征的产前筛查具有重要的临床应用价值。

［1］Weinans MJ，Butler SA，Mantingh A，et al.Urinary hyperg1yeosylated hCG in first trimester screening for chromosomal abnormalities［J］.Prenatal Diagnosis，2000，20（12）：976-978.

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［本文编辑：吴蓉］

Feasibility of the dried blood spots specimen method used to screen prenatal Down’ssyndromeamong mid-term pregnant women

LIU Qing-yin①，LI Ya-ni，TU Bin，et al.①Clinical Labortary，No.150 Central Hospital of Chinese PLA，Luoyang，Henan 471000，China

ObjectiveTo explore the feasibility of the dried blood spots specimen methods used to screen prenatal Down’s syndrome among mid-term pregnant women.MethodsThe levels of serum Alpha-fetoprotein （AFP）and free beta-human chorionic gonadotropin（β-hCG）in dried blood specimen on filter paper were detected with the method of CLEIA.The variation coefficient，recovery rate and detection limit were estimated. The screening result of serum AFP and β-hCG in dried blood specimen on filter paper specimen methods was compared with that of routine serum methods.ResultsIn test AFP，the variation coefficient，recovery rate and detection limit was 2.1%-6.5%，96.2%and 0.5 ng/ml，respectively；in test β-hCG，the corresponding results was 3.9%-6.7%，98.4%and 0.5 ng/ml，respectively.The onset risk rate was 1/128，with an accordance rate of 98.89% compared with that of the gold standard of serum screening method which is universally accepted.A total of 1260 pregnant women were screned for prenatal Down＇s syndrome 74 were positive（5.9%）among whom one fetus was diagnosed as Down’s syndrome by detecting the chromosomes in the amniotic fluid.ConclusionThe method of CLEIA through dried blood spots specimen，substitutes for the routine serum method to detect the levels of AFP and β-hCG among mid-term pregnant women is convenient and feasible，and its screening result is accurate and reliable.

Dried blood specimen on filter paper；Down’s syndrome；Alpha-fetoprotein；Free beta-human chorionic gonadotropin

R714.5

A

471000河南洛阳，解放军150医院检验科（刘清银，胡晓丹，刘小庆）；044500山西永济，解放军空军永济场站医院（李娅妮）；471000河南洛阳，出入境检验检疫局体检科（涂斌）；河南省洛阳市第五人民医院检验科（周玉杰）

李娅妮，qingyinliu@163.com