磷酸伯氨喹原料及片剂中主要杂质的结构鉴定

2015-08-17李玉凤林春燕任杰红张赟华云南省食品药品检验所云南昆明650011

云南科技管理 2015年3期

关键词：液相色谱仪药典磷酸

李玉凤，林春燕，任杰红，张赟华*（云南省食品药品检验所，云南昆明 650011）

李玉凤，林春燕，任杰红，张赟华*
（云南省食品药品检验所，云南昆明 650011）

采用LC-MS 联用技术进行鉴定；利用半制备高效液相色谱从磷酸伯氨喹原料中分离制备该杂质，进一步采用核磁技术进行结构确证。得到了磷酸伯氨喹原料的1个主要杂质的结构确证结果，对磷酸伯氨喹原料的杂质分析、质量控制和生产工艺的改进具有重要作用。

磷酸伯氨喹原料；磷酸伯氨喹片剂；杂质结构；液质联用；半制备高效液相色谱；核磁鉴定

0 引言

伯氨喹由Elderfield于1946年化学合成，并于1955年改良工艺，其成盐形式有磷酸盐与草酸盐两种，主要应用形式为磷酸伯氨喹，其药用价值很快被发现并应用于临床，作为抗疟药载入英美药典。磷酸伯氨喹于《中国药典》1963年版首次收载，此后每版《中国药典》均收载了该品种。磷酸伯氨喹包括美国药典规定的对照品中都含有明显的特殊杂质，但《中国药典》2010年版二部酸伯氨喹原料项下仅用薄层色谱法来控制杂质总量，未控制特殊杂质的限量。国内外文献有过对此杂质的一些结构推测，国内认为是光学异构体，国外文献有的认为是叔氨喹，有的认为是异伯喹。但都未做结构鉴定，只有推测。本文采用液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术对该杂质的结构进行初步分析，并进一步利用半制备高效液相色谱从磷酸伯氨喹原料中分离制备该杂质，采用核磁技术进行了结构确证，从而为磷酸伯氨喹的质量控制、生产工艺的改进提供依据，图1 为磷酸伯氨喹的化学结构

图1 磷酸伯氨喹的化学结构

1　仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪，Agilent 1200高效液相色谱仪，waters质谱仪，waters半制备液相色谱仪，avance核磁共振波谱仪，mettler电子天平。

甲醇（色谱纯，Merck 公司），超纯水，甲酸，磷酸伯氨喹对照品（usp），3批磷酸伯氨喹片样品收集自1个厂家，4批磷酸伯氨喹原料收集自2个厂家。

2　磷酸伯氨喹的杂质考察

2.1常规液相色谱法

2.1.1色谱条件

图2 磷酸伯氨喹对照品色谱图

图3 磷酸伯氨喹样品色谱图（12批次样品的色谱图）

2.1.2溶液的制备

原料药：精密称取磷酸伯氨喹原料20mg，置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

磷酸伯氨喹片：取该品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于磷酸伯氨喹10mg）置50mL量瓶中，加流动相适量，超声处理使其溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

另取磷酸伯氨喹对照品适量，加流动相制成每1 mL 中约含0.2mg的溶液，摇匀即得。

2.1. 3 杂质的考察与结果

以“2.1. 2”项下方法对3 批次磷酸伯氨喹片、4批次磷酸伯氨喹原料进行杂质考察，发现在7 批次样品的色谱图中，有一主成分峰，主峰前有一共同明显的杂质峰，称其为杂质1。以购买到的磷酸伯氨喹对照品进样，也有同样的两个峰，如图2和图3所示。

2.2液相色谱与质谱联用法

液相条件：Waters e2695高效液相色谱仪，采用3.5μm，4.6×150mm Waters SunFire的C18色谱柱；以戊烷磺酸钠溶液—甲醇（50∶50）为流动相；流速为0.5mL/min，检测波长为264nm。

式(10)表示根据zn,p,h,kn,p,f,wn,p计算每一个分块p与芯片f分区交集数值上限，式(11)规约分块p在左右两侧与f分区部分相交时重叠区域的范围.

质谱条件：离子源为ESI，质量分析器为四极杆飞行时间，正离子检测模式，离子扫描范围m/ z 50～ 1500，离子源前进样分流比为3∶ 1。离子源参数：毛细管电压3. 5 kV，喷雾电压0. 31 MPa，脱溶剂气（ N2）流量为10 L·min - 1，干燥气温度350 ℃，碎裂电压120 V，碰撞能量15 eV。

溶液制备同2.1.2项下。

结果：杂质1与主成分2个组分结构不同，见图4，图5。

图4 杂质1的质谱图

图5 磷酸伯氨喹（主峰）的质谱图

3　杂质1的分离与结构鉴定

3.1杂质1的分离

利用制备液相色谱法进行杂质1分离。Agilent 1200液相色谱仪，采用Agilent ZORBAX StableBond C18 规格： 250mm*9.4mm*5um色谱柱，以40%甲醇-0.5%甲酸水为流动相，流速1. 0 mL·min - 1，检测波长264nm，进样量50μl。

取磷酸伯氨喹原料制成100mg/mL的溶液按上述色谱条件进行杂质1的分离，并进行纯化，得到纯度大于98%的单体化合物20mg。

3.2杂质1的结构鉴定

杂质1通过MS、1H-NMR、13C-NMR及二维核磁进行结构分析与确认，得知杂质1为异伯喹（8-［（4-aninopentyl）anio］-6-methoxyquinoline），结构如图6所示。

图6杂质1 异伯喹（8-［（4-Aminopentyl）amino］-6-methoxyquinoline）的化学结构图

杂质1（异伯喹）1H-NMR（400MHz， C5D5N）：

8.67（1H， d， J=2.8Hz， H-2’）， 8.03（1H， dd，J=8.0，1.2Hz， H-4’）， 7.32（1H， dd， J=8.0， 2.8Hz，H-3’），6.74（1H， t，J=4.8Hz， 1-H）， 6.60（1H， d，J=2.4Hz，HHH H-7’）， 6.55（1H， d， J=2.4Hz， H-5’），3.81（3H， s， OCH3），3.25（2H， m， H-2），2.84（1H， m，H-5），1.73（2H， m， H- 3）， 1.39（2H，m，H-4）， 1.00（3H，d， J=5.6Hz， H-6）.

杂质1（异伯喹）13C-NMR（100MHz， D2O）： δ

160.0（C-6’），149.9（C-8’）， 146.4（C-9’），144.4（C-2’）， 134.8（C-4’）， 130.2（C-10’），122.1（C-3’）， 96.7（C-7’）， 92.0（C-5’），55.0（OCH3）， 47.0（C-5）， 43.4（C-2）， 37.8（C-4），26.0（C-3）， 24.3（C-6）.