利用高效液相色谱-蒸发光检测器法分析鮰鱼脑中磷脂组成

卢 航，里 慧，赵景华，何沁峰，李晶晶，丁宇宁，颜 泽，胡建恩（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连　116023）

利用高效液相色谱-蒸发光检测器法分析鮰鱼脑中磷脂组成

卢 航，里 慧，赵景华，何沁峰，李晶晶，丁宇宁，颜 泽，胡建恩*
（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁 大连116023）

对鮰鱼脑中的磷脂进行提取纯化，利用高效液相色谱-蒸发光检测器法对鮰鱼脑的磷脂含量进行检测。结果表明：鮰鱼脑磷脂中磷脂酰胆碱含量最高，占磷脂含量的45.73%，磷脂酰乙醇胺次之，含量为17.39%，磷脂酰丝氨酸含量为5.01%，磷脂酰肌醇含量为1.20%，相对较低。磷脂标准品在各自的质量浓度检测范围内线性关系良好，并且鮰鱼脑的磷脂中各组分分离效果良好，对于其他磷脂样品的测定也具有重要的参考价值。

鮰鱼脑；磷脂；高效液相色谱-蒸发光检测器；定量分析

鱼在加工过程中产生大量的副产物，包括鱼头、鱼皮、鱼骨等。鱼头营养丰富，除含蛋白质、脂肪、钙、磷、铁、VB等营养成分之外，还含有丰富的磷脂成分，且主要集中在鱼脑中，鲣鱼脑中磷脂含量为22.5 mg/100 g湿脑［1］，是可被利用的磷脂资源。目前，磷脂的各种生理调节功能受到人们广泛关注，现有研究［2］显示，磷脂具有抗衰老、调节血脂、减少胆固醇、强化脑部功能、提高记忆等功能。Fran［3］发现卵磷脂与记忆功能有关；Harrison等［4］发现磷脂有减少贫血症状、增加血色素含量的功能；Friedman等［5］研究发现磷脂能使实验性动脉粥样硬化现象减退；Buang等［6］发现磷脂酰胆碱可以缓解大鼠由乳清酸诱导的脂肪肝。

随着人们生活质量的日益提高，消费习惯也在发生着变化，人们不再只是满足吃活鲜鱼，而是更多地转向营养化和具有保健功能的鱼加工产品。因此，鱼类副产物中的生物活性物质的提取和功能特性的改善研究，将为鱼类产业带来更多的经济价值和社会价值［7］。目前，磷脂分析常用的方法有薄层色谱法、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法、质谱和气相色谱-质谱联用等技术。随着质谱技术的发展，更为强大的液相色谱-质谱连用技术也用于磷脂的定向定量分析中。液相色谱-质谱连用技术不仅能将磷脂组间分离定量，还有助于未分离的同类磷脂化合物的检测［8-9］。目前，HPLC法是磷脂分离和定性分析的主要方法。正相色谱分离不同种类的磷脂主要基于头部基团极性大小；反相色谱分离磷脂主要基于磷脂上脂肪酸酰基链的疏水性不同，但是相比而言一般分离度较差，峰重合严重［8］。磷脂分析的流动相一般分为2 类：正己烷-异丙醇-水体系和氯仿-甲醇-水（氨水）体系［10］。各种来源的磷脂都是由多种不同分子构型的磷脂分子组成的混合物，并具有差异性，等度洗脱难以完全分离，紫外与示差择光检测器不适于梯度洗脱，而蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）法具有不受梯度洗脱及溶剂、基线干扰，灵敏度高等优点［11］。为此本实验将对HPLC-ELSD在鮰鱼脑磷脂中的应用展开研究。

1　　材料与方法

1.1材料与试剂

鮰鱼脑采自江苏海天滩涂有限公司，于－20 ℃条件下保存。

磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）、磷脂酰肌醇（proporphosphatidylinositol，PI）、溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine，LPC）标准品美国Sigma公司；正己烷、异丙醇（均为色谱级）瑞典Oceanpak公司；氯仿、甲醇、冰乙酸等其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

LaChrom Elite系列HPLC仪日本日立公司；Chromolith®Performan-ce-Si型正相硅胶色谱柱（100 mm×4.6 mm）德国默克公司；Alltech 2000 ELSD美国Grace公司。

1.3方法

1.3.1鮰鱼脑中总脂肪的提取

鮰鱼脑总脂肪采用Folch等［12］方法进行提取。将鮰鱼脑流水解冻，匀浆后冷冻干燥，取5 g样品转移至烧杯中，加入180 mL氯仿-甲醇（2∶1，V/V）溶液混合，搅拌，静置10 min后抽滤，收集滤液，滤渣重复2 次上述操作。将上述所得滤液合并至分液漏斗中，加入质量分数0.9% NaCl溶液，振荡摇匀后静置过夜分层，收集下层氯仿层，通过无水硫酸钠脱水后滤至旋蒸瓶，45 ℃真空旋蒸至干，所得残余物即为总脂肪。氮气吹干旋蒸瓶至恒质量后称质量，旋蒸瓶增加的质量即为总脂肪质量。

1.3.2鮰鱼脑中胆固醇含量的测定

参照GB/T 5009.128—2003《食品中胆固醇的测定》［13］方法，测定鮰鱼脑中胆固醇含量。

1.3.3鮰鱼脑总脂肪组分的分离测定

总脂肪组分的分离测定采用硅胶柱层析法［14］。称取100 g柱层析硅胶，在105 ℃活化1～2 h，取出冷却至室温。采用湿法装住，将活化好的硅胶加入300 mL氯仿搅拌均匀至没有气泡，然后边搅拌边缓缓倒入层析柱（35 cm×2.1 cm），待硅胶柱平衡后，将含有600 mg总脂肪的少量氯仿溶液上样，依次用氯仿洗脱中性脂，丙酮洗脱糖脂，甲醇洗脱磷脂，各自单独收集后旋蒸至干、称质量，得到各脂肪组分质量。

1.3.4鮰鱼脑磷脂纯化

鮰鱼脑总脂肪提取液经真空浓缩后，根据磷脂不溶于丙酮的性质，将冷丙酮（4 ℃）倒入总脂肪浓缩液中，不断搅拌，待沉淀析出后4 000 r/min离心5 min，吸取上清液，冷丙酮清洗沉淀，重复多次，直至上清液无色为止，用氮气吹干制得鮰鱼脑磷脂，于－20 ℃冷冻保存，备用。

1.3.5鮰鱼脑磷脂脂肪酸组成分析

制取的鮰鱼脑磷脂采用三氟化硼法甲酯化后，参照GB/T 17377—2008《动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析》［15］的方法，进行鮰鱼脑的磷脂脂肪酸组成分析。

1.3.6磷脂样品的制备

取适量鮰鱼脑磷脂样品，按照一定的质量浓度溶解于正己烷-异丙醇（3∶1，V/V）混合液中。HPLC进样前使用0.22 μm孔径有机相滤膜过滤杂质。进样量为20 μL。

1.3.7鮰鱼脑磷脂HPLC分析

ELSD采用分流模式，以空气作为雾化气，气体流速1.7 L/min，漂移管温度45 ℃。采用三元梯度洗脱，流动相A为正己烷（含0.04%三乙胺）；流动相B为异丙醇；流动相C为13%乙酸溶液。洗脱流速1.5 mL/min，柱温25 ℃［16］，梯度洗脱程序如表1所示。将PE、PI、PS、PC、SM、LPC标准品分别单独进样，记录出峰时间，以对样品磷脂进行定性。然后将各种配好的磷脂标准品按梯度进行稀释，以磷脂标品含量为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。最后，对鮰鱼脑的磷脂进行检测。按其各峰的出峰时间确定磷脂的种类，根据各种磷脂的标准曲线方程计算各磷脂组分的相对含量。

表1　　梯度洗脱流动相组成Table 1　　Ternary gradient mobile phase composition

2　结果与分析

2.1鮰鱼脑中脂质组成从表2可以看出，鮰鱼脑中总脂肪含量达37.65%；胆固醇占总脂肪比例为1.84%，低于鸡蛋中胆固醇含量（4%）［17］。磷脂占总脂肪的比例为43.17%，远大于大豆的6.67%，低于蛋黄的45.2%［18］。根据前期实验测定的鮰鱼脑中的含水量为85.76%，因此，以湿质量计算鮰鱼脑的磷脂含量为23.14 mg/100 g，接近于鱼脑湿质量的

表 22 　鮰鱼脑中总脂肪含量及胆固醇、中性脂、糖脂和磷脂比例TTaabbllee 22 　TToottaall lliippiiddss ccoonntteennttss aanndd pprrooppoorrttiioonnss ooff cchhoolleesstteerrooll， nneeuuttrraalllliippiiddss， ggllyyccoolliippiiddss aanndd pphhoosspphhoolliippiiddss iinn cchhaannnneell ccaattffi i sshh bbrraaiinn %

2.3%，干质量的16%。据文献［19］报道扇贝卵巢中磷脂占湿质量的1.0%，干质量的5.5%；鳕鱼卵中磷脂占湿质量的2.2%，干质量的7.6%，与这2 种海产类动物原料比较，鮰鱼脑的磷脂含量相对较高，因此以鮰鱼脑为原料开发磷脂，具有良好的发展空间。

2.2鮰鱼脑的磷脂脂肪酸组成

表 33 　鮰鱼脑的磷脂中主要的脂肪酸组成Taabbllee 33 　FFaattttyy aacciidd ccoommppoossiittiioonn ooff pphhoosspphhoolliippiiddss ffrroomm tthhee ffi i sshh bbrraaiinn %

由表3可以看出，鮰鱼脑磷脂的脂肪酸主要有

C15∶1、C18∶0、C18∶1 n9c、C20∶5 n3、C22∶6 n3，且二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentenoic acid，EPA）含量分别为12.3%和1.7%。鮰鱼脑的磷脂中含有大量的不饱和脂肪酸，约占总脂肪酸的62.77%。

2.3混合磷脂标准品与鮰鱼脑的磷脂HPLC分析

由图1可以看出，在本实验的洗脱条件下，混合磷脂标准品和鱼脑磷脂中的所有磷脂组分均能达到基线分离，峰形良好，并且溶剂峰并不影响各磷脂的分离与定量分析。各磷脂标准品的标准曲线见表4。从表4可以看出，各磷脂标准品的回归方程的线性相关系数均大于0.99，说明ELSD的输出信号与进样量的对应关系在本实验所选定的检测范围之内是线性的。

图1　 磷脂标准品（AA）　、鮰鱼脑的磷脂（B）HPLC-EELLSSDD图Fig.1　Chromatogram of phospholipids from channel catfi sh brain by HPLC-ELSD

表 4　磷脂标准曲线方程及R2值Table 4　Equations andd R2values of calibration curves for phospholipid standaarrddss

2.4鮰鱼脑的磷脂组成

表 55 　鮰鱼脑的磷脂组成Taabbllee 55 　PPhhoosspphhoolliippiidd ccoommppoossiittiioonnss ooff cchhaannnneell ffi i sshh bbrraaiinn%

从表5可以看出，在鮰鱼脑磷脂中PC是磷脂的重要组成部分，占鮰鱼脑的磷脂45.73%。PE同样也占磷脂组成的很大比例，达到鱼脑磷脂的17.39%。在鮰鱼脑的磷脂中，存在一定量的PI以及PS，含量分别为1.20%和5.01%。鮰鱼脑的磷脂中并未检测出SM以及LPC。

3　讨 论

磷脂作为一种功能性脂质在生命代谢活动中有极其重要的作用［20］，此外，磷脂是天然的表面乳化剂，具有乳化、分散、润湿、速溶、脱膜、分离等作用［21］。其可以调节脂质代谢，降低血脂中甘油三酯和胆固醇水平。多烯磷脂酰胆碱作为磷脂的一种已在临床上作为肝病辅助治疗药得到广泛利用［22］，因此磷脂生物活性包括减肥、抗癌、降血糖等方面［23-25］，也必将越来越受到人们的重视。而对其所含磷脂组成的分析方法，将为其利用提供科学的依据。本实验利用正己烷-异丙醇-水体系为流动相进行梯度洗脱，在选定的色谱条件下，可以快速对各磷脂类组分完成检测分析，并且各组分峰的分离效果良好并且线性关系良好，表明该方法是一种快速、准确测定磷脂含量的分析方法，也可应用于其他来源磷脂组成的检测。

［1］张丽. 鲣鱼脑的磷脂提取及活性研究［D］. 大连： 大连海洋大学，2012.

［2］吴世芳. 何首乌中磷脂类化合物的提取、分离及分析方法研究［D］.南昌： 南昌大学， 2007.

［3］FRAN L B. Lecithin fraction linked to memory functioning［J］. Prepared Foods， 1998， 167（8）: 129.

［4］HARRISONE E， AADJEI A， AMEHO C， et al. The effect of soybean protein on bone loss in a rat model of postmenopausal osteoporosis［J］. Journal of Nutritional Science and Vitaminology， 1998， 44（2）: 257-268.

［5］FRIEDMAN M， BYER S O， ROSEMAN R H. Resolution of aortic atherosclerotic infiltration in the rabbit by phosphatide in fusion［J］. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine，1957， 95（3）: 586-588.

［6］BUANG Y， WANG Yuming， CHA J Y， et al. Dietary phosphatidylcholine alleviates fatty liver induced by orotic acid［J］. Nutrition， 2005， 21: 867-873.

［7］陈海光， 黄东雨， FELICIA K. 海洋鱼类废弃物功能成分提取的研究［J］.食品与机械， 2010， 26（3）： 173-176.

［8］姚凯， 薛芸， 李静， 等. 磷脂分析方法的研究进展［J］. 现代生物医学进展， 2014， 15（14）： 2972-2975.

［9］朱超. 基于液相色谱质谱联用技术的磷脂组学平台的建立、改进及应用［D］. 上海： 华东理工大学， 2011.

［10］ 曹栋. HPLC-ESLD法分离测定大豆磷脂酰胆碱［J］. 中国油脂， 2005，30（12）： 43-45.

［11］ MARTIN G， DIETER J. Improved separation and quantification of neutral and polar lipid classes by HPLC-ELSD using a monolithic silica phase： application to exceptional marine lipids［J］. Journal of Chromatography B， 2009， 877： 1815-1819.

［12］ FOLCH J， LEES M， STANLE Y. A simple method for the isolation and purifi cation of total lipids from animal tissues［J］. Journal of Biological Chemistry， 1957， 226： 497-509.

［13］ 卫生部， 中国国家标准化管理委员会. GB/T 5009.128—2003 食品中胆固醇的测定［S］. 北京： 中国标准出版社， 2003.

［14］ 张智翠. 太平洋牡蛎品质的季节性变化及贮藏过程中的生化变化［D］.青岛： 中国海洋大学， 2006.

［15］ 国家质量监督检验检疫总局， 中国国家标准化管理委员会. GB/T 17377—2008 动植物油脂脂肪酸甲脂的气相色谱分析［S］. 北京： 中国标准出版社， 2008.

［16］ GRZEGORZ K， PIOTR M， CZESŁAW W. A new liquid chromatography method with charge aerosol detector （CAD） for the determination of phospholipid classes. Application to milk phospholipids［J］. Talanta， 2013， 105： 28-33.

［17］ 李志军， 王玲玲， 吕宁华. 水产保健食品的研究现状与展望［J］. 食品工业， 2003， 24（5）： 42-43.

［18］ 林洪， 江洁， 许加超， 等. 贻贝磷脂与大豆磷脂卵黄磷脂组成的比较研究［J］. 营养学报， 2002， 24（1）： 87-89.

［19］ 王琦. 海产动物来源n-3 PUFA磷脂的提取及生物活性研究［D］. 青岛： 中国海洋大学， 2008.

［20］ MAN D， PODOLAK M. Tin compounds interaction with membranes of egg lecithin liposmes［J］. Zeitschrift Fur Naturforschung， 2007， 62：427-432.

［21］ 张苓花， 叶淑红， 王晨祥， 等. 酶法合成DHA/EPA型卵磷脂的研究［J］.大连轻工业学院学报， 2000， 19（1）： 45-47.

［22］ 何俊婷. 多烯磷脂酰胆碱分离与制剂工艺研究［D］. 西安： 西北大学， 2011.

［23］ 刘艳青. 皱纹盘鲍地域及季节性差异分析及内脏磷脂减肥活性研究［D］. 青岛： 中国海洋大学， 2013.

［24］ 马琴. 二十二碳六烯酸-磷脂生物活性的研究［D］. 青岛： 中国海洋大学， 2009.

［25］ 胡世伟， 王静凤， 徐雷雷， 等. 海参磷脂型二十碳五烯酸降血糖作用机制的研究［J］. 营养学报， 2013， 35（5）： 445-449.

Determination of Phospholipids in Channel Catfi sh Brain by High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector （HPLC-ELSD）

LU Hang， LI Hui， ZHAO Jinghua， HE Qinfeng， LI Jingjing， DING Yuning， YAN Ze， HU Jian'en*（College of Food Science and Engineering， Dalian Ocean University， Dalian116023， China）

In this paper， the phospholipids in the brain of channel catfi sh were extracted and purifi ed. A high-performance liquid chromatography equipped with an evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD） was used to analyze the phospholipid components. The results indicated that the content of phosphatidylcholine （PC） was the highest among the detected phospholipids phospholipids in channel catfish brain， which accounted for 45.73% of the total phospholipids，followed by phosphatidylethanolamine （PE）， which accounted for 17.39%. The proportions of phosphatidylserine （PS）and proporphosphatidylinositol （PI） in relative to the total phospholipids were 5.01% and 1.20%， respectively. Under optimized experimental conditions， the respective peak areas were fi nely fitted to a linear model within the indicated range， and each class of phospholipids was separated well. The method also can be applicable for the determination of phospholipids in other samples.

channel catfish brain； phospholipids； high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector （HPLC-ELSD）； quantitative analysis

TS254.9

A

1002-6630（2015）24-0177-04

10.7506/spkx1002-6630-201524032

2015-03-24

辽宁省教育厅科学研究一般项目（L2012257）

卢航（1982—），女，讲师，博士，研究方向为海洋副产物利用。E-mail：luhang@dlou.edu.cn

胡建恩（1962—），男，教授，博士，研究方向为海洋副产物利用。E-mail：huje@dlou.edu.cn