响应面试验优化桑叶茶中游离氨基酸与多酚的提取工艺

王星天，李桂水，程丽君，李 毅，陶思佚，张 冰（天津市轻工与食品工程机械装备集成设计与在线监控重点实验室，天津科技大学机械工程学院，天津　300222）

响应面试验优化桑叶茶中游离氨基酸与多酚的提取工艺

王星天，李桂水*，程丽君，李 毅，陶思佚，张 冰
（天津市轻工与食品工程机械装备集成设计与在线监控重点实验室，天津科技大学机械工程学院，天津300222）

为了使桑叶茶饮料达到较好的口感和较高营养价值，通过水浸提法同时提取桑叶茶中游离氨基酸与多酚两种成分，利用响应面法对工艺参数进行优化。结果表明，桑叶茶最佳的浸提条件是浸提温度89 ℃、水茶比87∶1 （mL/g）、浸提时间16 min。该条件下得到的游离氨基酸提取量为21.46 mg/g，多酚提取量为14.32 mg/g，与理论值误差较小，说明通过Design-Expert软件建立的二次多项数学模型准确可行，优化的浸提工艺稳定可靠，为桑叶茶饮料开发的相关研究提供了参考。

桑叶茶；响应面法；多酚；游离氨基酸；提取

桑叶又称“东方神仙叶”，富含多种氨基酸、多酚、维生素、矿物质、植物纤维以及丰富的钾、钙，还有多种对人体有益的微量元素及多种生物活性物质［1-2］。其中氨基酸不仅是构成茶叶品质滋味的重要组成部分，而且它们对茶叶香气的形成也有重要作用，在茶叶领域中的相关研究［3］表明，茶叶中氨基酸含量是决定茶叶品质级别的主要因素。桑叶茶中的多酚包括槲皮苷、槲皮素、绿原酸、芦丁、没食子酸等［4］。桑叶中多酚因其化学结构具有活泼的羟基氧，能在多酚氧化酶作用下终止生物体内自由基的连锁反应，起到清除自由基和消除自由基毒性的作用［5］，从而表现出抗氧化［6］、抗衰老［7］、防治肿瘤［8］及增加机体免疫力［9］等多种生物活性。但在桑叶饮料的工艺研制［10］和生产［11］中对桑叶茶的浸提工艺都是通过感官评价指标来优化，有一定主观性，缺乏准确数据支撑，且没有考虑到各个影响因素之间的交互性。

响应面法是一种有效的试验设计方法，该方法基于试验数据，通过建立数学模型来解决受多因素影响的最优组合问题，可以在更广泛的范围内考虑因素的组合、预测响应值，比一次次的单因素分析方法更有效［12］。

本研究针对桑叶茶中含量较为丰富的游离氨基酸和多酚两种有益成分同步进行提取工艺的研究，基于准确的数据，通过响应面法建立多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系［13］，充分考虑各因素之间的影响，从而得到两种成分共同最优的提取工艺，使得桑叶茶浸提后从口感和保健的价值上都可以达到较高的水平，为以后的桑叶茶饮料制取的浸提工艺提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

谷氨酸标准品（纯度99%）中国标准物质网；桑叶茶（每100 g含有氨基酸总量约为17.249 g）江苏缘生堂；水合茚三酮、硫酸亚铁、酒石酸钾钠等（均为分析纯）天津市大茂化学试剂厂。

1.2仪器与设备

HC-400Y2粉碎机永康市天祺盛世工贸有限公司；SC-15水浴箱上海比朗仪器有限公司；722型可见分光光度计上海菁华科技仪器有限公司；TD12001分析天平奥豪斯国际贸易（上海）有限公司。

1.3方法

1.3.1样品处理

将实验用桑叶茶开封后即用高速粉碎机粉碎至70～300 目，之后混匀密封备用。

1.3.2游离氨基酸与多酚的提取

准确称取一定量桑叶茶粉末，加入100 mL去离子水配成一定水茶比的料液，在一定浸提温度条件下浸提一定时间，浸提液冷却后减压过滤，将过滤后的浸提液定容至100 mL，并记录滤液质量。

1.3.3响应面法优化游离氨基酸与多酚的提取工艺

根据Box-Behnken试验设计原理，结合单因素试验结果，选取浸提温度、水茶比和浸提时间3 个影响因素，在单因素试验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，桑叶茶试验因素与水平参见表1，有17 个试验点，其中12 个为析因点，5 个为零点，零点共试验了5 次，以估计误差［14-18］。

表1　桑叶茶浸提试验的因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken experimental design

1.3.4桑叶茶主要成分的测定

多酚含量测定方法参见GB/T 21733—2008《茶饮料》；游离氨基酸含量测定方法参见GB/T 8314—2013《茶：游离氨基酸总量的测定》。

氨基酸标准曲线绘制：称取250 mg谷氨酸纯品溶于水中并定容至25 mL，分别移取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL之后再分别加水定容至50 mL，分别吸取这5组谷氨酸标准溶液各1 mL，分别加入0.5 mL pH 6.8的磷酸盐缓冲液和0.5 mL的2%茚三酮溶液，沸水浴中加热15 min，冷却后加水定容至25 mL，在579 nm波长处测其吸光度，用最小二乘法经线性回归后得到，相关系数R=0.999 8，式中：C为氨基酸质量浓度/（mg/mL）；A为吸光度。

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1浸提温度对游离氨基酸和多酚提取量的影响

图 1　浸提温度对桑叶茶中游离氨基酸和多酚提取量的影响Fig.1　Effect of extraction temperature on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

为考察浸提温度对游离氨基酸和多酚提取量的影响，分别在50、55、60、65、70、75、80、85、90 ℃条件下对桑叶茶进行了浸提，由图1可知，在水茶比90∶1（mL/g）、浸提时间20 min的条件下，游离氨基酸提取量在55～60 ℃有明显的上升，之后随着温度上升呈现较为稳定的增长趋势，并从80 ℃开始提取量基本保持稳定；多酚提取量在70 ℃之前随温度升高缓慢增长，从70 ℃开始呈现明显的增长，并在85 ℃开始，提取量基本保持稳定。游离氨基酸分子质量较小且含量更多，相比多酚更易溶出，而茶多酚主要分布在叶肉组织深层，稳定性好，要较高的温度才能溶出［19］，故温度变化对其浸出的影响较大，这与先前学者的研究［20-21］一致。综合考虑两者的提取量，浸提温度选择85 ℃较为合适。

图 2　水茶比对桑叶茶中游离氨基酸和多酚提取量的影响Fig.2　Effect of ratio of tea to water on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

2.1.2水茶比对游离氨基酸和多酚提取量的影响为考察水茶比对游离氨基酸和多酚提取量的影响，分别对50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1、

110∶1、130∶1、150∶1（mL/g）水茶比的桑叶茶进行了浸提，如图2所示，在浸提温度85 ℃、浸提时间20 min

条件下，随着水茶比的增大，游离氨基酸的提取量在

50∶1～90∶1之间增加速率较快，并从90∶1（mL/g）开始提取量基本保持稳定；多酚提取量在水茶比50∶1～90∶1

范围呈现增长，在90∶1之后提取量有些微小的上下浮动，但提取量基本保持稳定。随水茶比的增加，桑叶中游离氨基酸和多酚提取量上升至最高值之后趋于稳定，这是由于两种成分浸出完全，增加溶剂并不能起到增加提取量的效果［22］。因此综合两种成分的提取量，水茶比选择90∶1（mL/g）较为合适。

2.1.3浸提时间对游离氨基酸和多酚提取量的影响

图 3　浸提时间对桑叶茶中游离氨基酸和多酚提取量的影响Fig.3　Effect of extraction time on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

为考察浸提时间对游离氨基酸和多酚提取量的影响，本试验分别在对应5、10、15、20、25、30、35、45、60 min浸提时间条件下的桑叶茶进行了浸提，如图3所示，在浸提温度85 ℃、水茶比90∶1（mL/g）的条件下，随着浸提时间的延长，桑叶中游离氨基酸提取量在5～15 min间有显著的增加，15 min之后提取量基本保持稳定；桑叶多酚提取量在10～15 min区间有显著增加，15～20 min增加趋势变缓，在20～45 min区间内提取量基本保持稳定，之后随着浸提时间的延长又有了明显的下降趋势。这可能与浸提的原理有关，固-液浸提过程为3步：1）溶剂进入固体内部，溶质溶解；2）溶质从固体内部到表面；3）溶质溶解液从固体表面到溶剂中。游离氨基酸的分子质量较小，较多酚而言能够更快的溶出，超过一定的时间后，多酚溶出量开始上升，而游离氨基酸则大部分已溶出，延长时间也对游离氨基酸的溶出意义不大［23］。而多酚提取量随浸提时间延长之后出现下降，是由于多酚已经基本浸提完全，随时间的延长引起降解、转化或络合［24-25］。因此综合两种成分的提取量，时间并不是越长越好，选用20 min作为桑叶茶的浸提时间较为合适。

2.2响应面试验结果

2.2.1响应面试验设计及结果

表2为Design-Expert中根据Box-Behnken试验所给出的桑叶茶的试验设计和试验结果。

表2　桑叶茶浸提试验设计与试验结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2模型的建立及其显著性检验

利用Design-Expert软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到游离氨基酸和多酚提取量对浸提温度（A）、水茶比（B）和浸提时间（C）的二次多项式回归模型为：

游离氨基酸提取量/（mg/g）=－4.969 08+0.385 16A+ 0.195 81B－0.058 285C－1.14×10－3AB+6.675×10－4AC+ 5.362 5×10－4BC－1.568 5×10－3A2－5.583 75×10－4B2－1.331×10－3C2

多酚提取量/（mg/g）=－212.061 15+4.551 07A+ 0.339 23B+0.954 33C+7.687 5×10－4AB－7.017 5×10－3AC－1.818 75×10－3BC－0.025 338A2－1.898 31×10－3B2－6.373 25×10－3C2

表3　桑叶茶游离氨基酸浸提回归模型的方差分析结果Table 3 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of free amino acids from mulberry leaf tea

表 4　桑叶茶多酚浸提回归模型的方差分析结果Table 4 Analysis of variance for quadratic polynomial model forextraction of polyphenols from mulberry leaf

由表3、4可知，游离氨基酸浸提模型的P＜0.000 1，多酚浸提模型的P＜0.000 1，表明回归模型极显著；游离氨基酸浸提失拟项P=0.109 5，不显著，多酚浸提失拟项P=0.085 4，不显著；游离氨基酸浸提复相关系数R为0.993 0，多酚浸提复相关系数R为0.994 6，说明桑叶茶这两种有效成分的浸提模型拟合程度良好，试验误差小，可以用此模型来分析和预测桑叶茶浸提的工艺结果。

表5　桑叶茶游离氨基酸浸提回归模型系数的显著性检验结果Taabbllee 55 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn eexxttrraaccttiioonn ooff ffrreeee aammiinnoo aacciiddss ffrroomm mmuullbbeerrrryy lleeaaff tteeaa

由表5回归模型系数显著性检验结果可知，游离氨基酸模型的一次项、二次项及交互项均显著。表明各影响因素对于桑叶茶中浸游离氨基酸提取量的影响并不是简单的线性关系。

表6　桑叶茶多酚浸提回归模型系数的显著性检验结果TTaabbllee 66 　RReessuullttss ooff ssiiggnniiffi i ccaannccee tteesstt ffoorr rreeggrreessssiioonn ccooeeffffi i cciieennttss iinn extraction of polyphenols from mulberry leaf tea

由表6回归模型系数显著性检验结果可知，多酚模型的一次项、二次项均极显著，交互项AC、BC显著，AB不显著。表明各影响因素对于桑叶茶中多酚提取量的影响并不是简单的线性关系。

2.2.3桑叶茶浸提工艺的响应面

当浸提温度为90 ℃时，由图4可知，游离氨基酸提取量随着水茶比的增加而增加，并在水茶比达到85∶1（mL/g）左右提取量基本保持稳定，而随着浸提时间的延长，游离氨基酸的提取量变化不明显。随着水茶比的增加，多酚提取量逐渐增加，并在水茶比达到82∶1左右提取量基本保持稳定，随着浸提时间的延长，多酚提取量有所增加之后又出现些微下降，且水茶比越高这种趋势越明显。等高线的形状可以反映出交互效应的强弱。从图4等高线图可以看出，水茶比相对于浸提时间对游离氨基酸提取量的影响作用更为显著一些；对于多酚提取量则是在水茶比约82∶1之前，水茶比影响作用较浸提时间显著，而在水茶比达到约82∶1之后，则浸提时间的影响更为显著。

图 4　桑叶茶浸提过程中水茶比和浸提时间交互作用对提取量影响的响应面和等高线Fig.4　Response surface plot and contour plot showing the effect of ratio of water to tea and extraction time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

图 5　桑叶茶浸提过程中浸提温度和浸提时间交互作用对提取量影响的响应面和等高线Fig.5　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and time and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

当水茶比为90∶1（mL/g）时，由图5可知，随着浸提温度的上升，游离氨基酸的提取量也随之升高，并在浸提温度达到约85 ℃之后，游离氨基酸提取量基本保持稳定，而随着浸提时间的延长，桑叶茶中的游离氨基酸的提取量有些微增加但变化不明显。随着浸提温度的升高，多酚提取量随之增加，且在浸提温度达到约80 ℃之后，随着浸提时间的延长，多酚提取量都有所下降，随着浸提温度继续升高，这种趋势出现的时间越早且越明显。从图5等高线图可以看出，浸提温度对游离氨基酸提取量影响作用较浸提时间更为显著；对于多酚提取量在浸提温度约85 ℃之前，浸提温度相对于浸提时间表现更为显著一些，而在85 ℃之后，两者对多酚提取量影响的交互性变得显著。

图 6　桑叶茶浸提过程中浸提温度和水茶比交互作用对提取量影响的响应面和等高线Fig.6　Response surface plot and contour plot of the effect of extraction temperature and ratio of water to tea and their mutual interaction on the extraction yields of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea

当浸提时间为20 min时，由图6可知，随着浸提温度和水茶比的升高和增加，游离氨基酸的提取量增加，随之浸出完全提取量渐渐趋于稳定。随着浸提温度升高多酚提取量增加，在浸提温度达到约84 ℃，多酚提取量达到相对最大值并保持稳定，至约93 ℃稳定结束，提取量开始略有下降，而在浸提温度84～93 ℃之间，随着水茶比的增加，多酚提取量增加，其余温度区间随着水茶比的增加多酚提取量变化不明显。由图6等高线图可知，浸提温度和水茶比对游离氨基酸的提取量都有显著的影响作用，交互作用明显；对于多酚提取量，浸提温度有着较为显著的影响作用。

比较上面的3组图可知，浸提温度和水茶比对桑叶茶中的游离氨基酸提取量的影响较为显著，表现为曲线较陡，浸提时间影响作用一般显著，表现为曲线相对较平缓，且随其数值的增加或减少，响应值的变化较小。浸提温度对桑叶茶中的多酚提取量的影响最为显著，其次是水茶比，浸提温度次之。

根据软件Design-Expert对桑叶茶中的游离氨基酸和多酚的模型进行计算，将这两个响应值的重要性设定为同等重要，并考虑到不同条件下的能耗问题，选取模型中的最优浸提条件，得出最佳浸提温度88.62 ℃、水茶比86.83∶1（mL/g）、浸提时间16.06 min，在此条件下游离氨基酸提取量可达到21.28 mg/g，多酚提取量可达到14.48 mg/g。

为检验响应面方法所得结果的可靠性，采用上述优化浸提条件对桑叶茶进行浸提，考虑到实际操作的便利，将浸提工艺参数修正为：浸提温度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提时间16 min。在此条件下浸提3 次，实际测得游离氨基酸提取量为21.46 mg/g，多酚提取量为14.32 mg/g，与理论预测值相比，游离氨基酸的相对误差为0.85%，茶多酚的误差率为1.10%。因此，基于响应面所得的优化浸提工艺参数准确可靠，具有实用价值。

3　结 论

利用响应面法，通过二次回归设计得到桑叶茶游离氨基酸和多酚与浸提温度、水茶比、浸提时间关系的回归模型，从模型的响应面及其等高线对影响桑叶茶游离氨基酸和多酚提取量的3 个关键因素及其相互作用进行了探讨。并得出最佳条件为浸提温度89 ℃、水茶比87∶1（mL/g）、浸提时间16 min，该条件下得两种成分的提取量分别是：游离氨基酸21.46 mg/g，多酚14.32 mg/g。

因此选取两种主要成分作为响应值，通过响应面法对桑叶茶浸提工艺进行研究优化，充分考虑到不同操作条件之间的相互影响作用，以及使得不同成分提取量的最大化所对应的操作条件的差异，建立合理有效的模型进行系统的分析优化，减少了针对单个因素分别实验的盲目性，从而在有效的模型中得到最优浸提条件，并对模型得出的最优条件下的预测值进行验证，充分证明了模型结果的准确性，为桑叶茶浸提工艺的研究提供了参考。

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Optimization of the Extraction Process of Free Amino Acids and Polyphenols from Mulberry Leaf Tea by Response Surface Methodology

WANG Xingtian， LI Guishui*， CHENG Lijun， LI Yi， TAO Siyi， ZHANG Bing
（Tianjin Key Laboratory of Integrated Design and On-line Monitoring for Light Industry and Food Machinery and Equipment，College of Mechanical Engineering， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin300222， China）

In order to achieve good taste and high nutritional value for mulberry leaf tea beverage， the extraction simultaneous process of free amino acids and polyphenols from mulberry leaf tea using water as the extractant was optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction temperature， water/tea ratio and extraction time were 89 ℃， 87:1 （mL/g）， and 16 min， respectively. Under these conditions， the extraction yields of free amino acids and polyphenosl were experimentally determined to be 21.46 and 14.32 mg/g， respectively， which were both close to the predicted values. These results indicate the quadratic polynomial mathematical model built by Design-Expert software was accurate and feasible and the optimized extraction process was stable and reliable. This study can provide a reference for the development of mulberry leaf tea beverage.

mulberry leaf tea； response surfa ce methodology （RSM）； polyphenols； free amino acids； extraction

TS272

A

1002-6630（2015）24-0083-06

10.7506/spkx1002-6630-201524014

2015-04-26

王星天（1991—），男，硕士研究生，研究方向为非均相分离。E-mail：wangxingtian525@126.com*

李桂水（1965—），男，副教授，硕士，研究方向为非均相分离。E-mail：liguishui@tust.edu.cn