响应面试验优化酪蛋白-魔芋葡甘聚糖共混溶胶制备工艺及其稳定性

樊 巧，陈厚荣，徐晓萍，田美玲，张甫生（西南大学食品科学学院，重庆　400715）

响应面试验优化酪蛋白-魔芋葡甘聚糖共混溶胶制备工艺及其稳定性

樊 巧，陈厚荣，徐晓萍，田美玲，张甫生*
（西南大学食品科学学院，重庆400715）

为提高蛋白-多糖共混物的稳定性及拓宽其在食品领域的应用，以酪蛋白（casein，CS）-魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）为研究对象，探究了共混溶胶制备过程中CS-KGM总质量浓度、共混比例、pH值、反应温度对CS-KGM共混溶胶流变特性的影响，并以黏度为指标，用响应面法对共混比例、pH值、反应温度进行共混工艺优化。在总质量浓度为1.2 g/100 mL的基础上，响应面优化结果表明3 个因素对共混溶胶均有显著的影响，其最佳优化工艺参数为：共混比例（KGM-CS质量比）6∶4、反应温度60 ℃、pH 6.5；在此条件下，CS-KGM共混溶胶黏度的验证值为33.63 Pa·s，与理论预测值35.12 Pa·s相近。同时，将优化前和优化后共混溶胶进行贮藏稳定性对比实验，显示优化前与优化后共混溶胶出现相分离现象时间分别为4 d和5 d，优化后稳定性显著高于优化前共混溶胶。

魔芋葡甘聚糖；酪蛋白；流变性；响应面；稳定性

蛋白与多糖是最常见的食品高分子聚合物，是构建食品微结构的两大重要基材，由于蛋白-多糖混合物在许多食品的结构、质地和稳定性方面起到了重要作用，蛋白-多糖已广泛用于食品工业［1］。但二者共混体系具热力学不稳定特征［2］，目前，改善多糖-蛋白共混物的稳定性，提升其性能的快捷途径是对多糖-蛋白共混物进行共混工艺参数的调节，如共混物质量浓度、溶解反应温度、pH值和溶质添加（如盐或其他低分子质量的物质）等因素［3］。因此，为了开发食品新产品所需的性能，认识多糖-蛋白共混各因素对其影响、二者相互作用机制以及探索共混宏观属性等非常重要。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）作为目前所发现植物类水溶性食用胶中黏度最高的一种多糖［4］，因具有高吸水性、高膨胀性、高黏度等优良特点，其与蛋白的共混物已广泛应用于食品包装膜［5］、脂肪替代品［6］、澄清剂［7］等方面。酪蛋白（casein，CS）作为牛奶中的主要蛋白质，其分子具有双亲性，分子柔性好，具有优良的凝胶特性。研究证明，多糖能够改善乳制品的质地，赋予产品稳定的液体状态或是凝胶状态［8］；且多糖能够抑制乳清析出、乳脂分离，延长乳制品的货架期［9-10］，国内外对CS与多糖混合体系的研究也逐渐增多，但将资源丰富的KGM与CS共混研究却鲜见报道，CS与KGM共混体系等方面的研究有待进一步深入。

基于此，本实验以KGM与CS为研究对象，通过单因素试验、响应面研究方法，探讨共混溶胶制备过程中各因素对其性质的影响规律，并依此得出最佳的制备工艺条件，同时对优化前、后共混溶胶进行贮藏稳定性实验，探究其稳定性能的提升效果，以期为CS与KGM的应用（共混膜的制备、奶制品加工等）提供理论性指导，及为后期研究CS与KGM之间的相互作用研究提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

CS美国Sigma公司；KGM（质量分数92%）上海北连生物科技有限公司；磷酸氢二钠（质量分数99%）、磷酸二氢钠（质量分数99%）重庆北碚化学试剂厂。

1.2仪器与设备

JJ-1精密增力电动搅拌器金坛市城东新瑞仪器厂；HH-2数显恒温水浴锅常州奥华仪器有限公司；SL602N高精显电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司；DHR-1动态流变仪 美国TA公司。

1.3方法

1.3.1CS-KGM复合溶胶的制备

称取与实验对应量的CS，加入10 mL的磷酸盐缓冲液，搅拌均匀，待CS溶解，加入90 mL蒸馏水，边搅拌边加入与实验相对应量的KGM，在一定反应温度条件下使CS和KGM充分溶胀并反应45 min，样品在4 ℃条件下保存20 h待用。

1.3.2CS-KGM复合溶胶流变性能分析

采用TA流变仪对复合溶胶进行流变测试，测试夹具，40 mm平行板；测试间距为500 μm，测试反应温度为25 ℃，上样品后平衡5 min，频率1 Hz，剪切频率0.1～600 s－1。样品单点的表观黏度是所得溶液测定表观黏度的初始点值［11］。

1.3.3CS-KGM复合溶胶稳定性分析

根据优化前与优化后的实验条件，制备两组样品，在4 ℃条件下保存过夜后将样品置于25 ℃室温，观察两组样品随时间变化的相分离情况。

1.3.4单因素试验设计

选取CS-KGM总质量浓度0.5～1.6 g/100 mL、共混比例（KGM-CS质量比）10∶0～2∶8、缓冲液pH 6～8和反应温度25～90 ℃为试验因素，研究这4 个因素对溶胶流变黏度的影响效果。

1.3.5响应面试验设计

在单因素试验结果的基础上，通过Design-Expert响应面软件，选择对试验影响较大的共混比例、反应温度、pH值为响应因素，以CS-KGM复合溶胶黏度为响应值，设计三因素三水平的响应面试验。响应面试验设计如表1所示。

表1　响应面试验因素与水平Taabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd lleevveellss uusseedd iinn rreessppoonnssee ssuurrffaaccee ddeessiiggnn

1.4数据统计与分析

实验数据均用Origin 7.5与Design-Expert进行处理与分析，每次实验均3次平行，结果以“±s”的形式标注于图。

2　结果与分析

2.1CS对KGM流变性的影响

天然高分子材料的最终性能很大程度上取决于其内在结构和成分，体系的黏弹性是其微观结构及其内部基团间相互作用的宏观表现，故常用流变黏度来表征共混分子之间相互作用的强弱［12-13］。通过对比单独CS、单独KGM以及共混CS和KGM时黏度随剪切速率变化的曲线，来观察CS添加对KGM溶液黏度的影响。

图 1 CS、KGM、CS-KGM共混溶胶剪切速率与黏度相关性曲线Fig.1　Relationship between shear rate and viscosity for CS， KGM and CS-KGM blend sol

由图1可知，3 种溶液均表现出非牛顿流体行为，且均发生剪切变稀现象。同时由于CS的黏度远低于KGM的黏度［14］，故CS的加入，使KGM黏度急剧下降；总质量浓度在1 g/100 mL基础上，加入质量浓度0.5 g/100 mL CS，黏度从59.22 Pa·s下降至7.05 Pa·s，略高于1 g/100 mL CS的黏度（0.12 Pa·s），黏度下降了88%。此外，高分子溶液流变学常用Ostwald幂律函数方程τ=k·γn来描述。依上述方程，经计算得出，CS、KGM、CS-KGM的n值均小于1，可说明这3 种流体均为假塑性流体，与图1中得出的黏度随剪切速率的增加而降低的实验结果相似。其中，3 种流体中KGM的k值最高、CS-KGM次之、CS最低，体现出了KGM和CS-KGM具有的较高黏度。同时CS-KGM为两者的共混溶胶，其k、n值处于CS和KGM之间，也与图1的结果一致。

2.2单因素试验结果

2.2.1总质量浓度对CS-KGM共混物黏度的影响

CS-KGM共混物的总质量浓度直接影响到溶胶状态。在KGM-CS共混比例7∶3、缓冲液pH 7的条件下，考察总质量浓度分别为0.5、0.7、1.0、1.2、1.4、1.6 g/100 mL时共混物黏度性能，结果见图2。

图2　 总质量浓度对CS-KGM共混溶胶黏度的影响Fig.2　Effects of total substrate concentration on viscosity of CS-KGM blend sol

一般在稀溶液中，水溶胶大分子呈线团状，相互分离。当质量浓度增加到某临界质量浓度后，大分子线团间相互发生穿插交叠，分子间相互作用增强，大分子由相互孤立运动状态向相互缠结状态转变，进而可导致溶液的黏度显著增加［15-16］。由图2可知，随着CS-KGM总质量浓度的增大，溶胶的黏度不断升高，且上升的速率不断增大，当总质量浓度大于1.2 g/100 mL时黏度增加幅度更明显。原因可能是由于总质量浓度的增加可使蛋白和多糖相互作用位点增加，从而促进了两者的静电等相互作用，进而提高溶液黏度。此结论与闵雯等［17］和刘金金等［18］对胶原蛋白-壳聚糖、蛋清蛋白-魔芋共混溶胶的研究结果一致。根据试验结果，总质量浓度在1.2 g/100 mL时溶胶状态较为理想，总质量浓度再增加时溶胶黏度过大接近凝胶，且流动性差。因此，选用共混溶胶总质量浓度为1.2 g/100 mL进行后期优化试验。

2.2.2共混比例对CS-KGM共混物黏度的影响

在共混物总质量浓度、pH值一定的条件下，只有当蛋白和多糖的共混比例达到一定值时，二者才能发生更好的相互作用。故试验通过对比不同共混比例条件下共混物的黏度，来分析共混比例对共混物黏度的影响。总质量浓度1.2 g/100 mL、缓冲液pH 7的条件下，考察共混比例分别为10∶0、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、2∶8时共混物黏度性能，结果见图3。由图3可知，在总质量浓度一定的条件下，随着

图 3　共混比例对CS-KGM共混溶胶黏度的影响Fig.3　Effects of KGM-CS ratio on viscosity of CS-KGM blend sol

KGM-CS共混比例的改变，共混物的黏度呈下降趋势。当共混物共混比例由10∶0变为8∶2，黏度急剧下降，这是由于KGM具有很强的吸水溶胀性，较高黏度［14］，当用CS

代替一部分KGM时，黏度会受到很大的影响，这也与前面CS加入对KGM流变性影响的研究结果一致。当共混比例由8∶2变为7∶3时，共混物黏度变化不明显，可能是由于KGM与CS共混会出现一定的交互作用，在此区间内，两者间达到了最大程度的结合；而当共混比例在7∶3之后时，黏度又开始急剧下降，可能是随着KGM含量的降低，高黏度KGM贡献作用减小，同时体系中单位体积内KGM

分子与CS颗粒之间的缠结和碰撞几率减小，体系中的大CSKGM颗粒变少等原因造成，因此黏度减小。这与杨敏华等［19］

对蚕丝蛋白-黏胶共混纺丝液的流变性能研究结果一致，在控制总质量浓度一定的情况下，体系中随着蛋白含量的增加，黏度逐渐减小。为此，依据黏度变化不显著，且较高黏度的原则，选择7∶3共混比例来进行后期优化试验。

2.2.3pH值对CS-KGM共混物黏度的影响

图4　pH值对CS-KGM共混溶胶黏度的影响Fig.4　Effects of pH on viscosity of CS-KGM blend sol

CS不易溶解水溶液，Liu等［20］研究发现CS在pH 6.0～8.0时溶解度显著增加，随后当pH值为9.0～12.0时溶解度减小；同时Kohyama等［21］观察了pH值对KGM黏度等性质的影响，结果发现pH值在3.0～9.0时KGM黏度较稳定。故选择pH值为6.0～8.0区间的磷酸盐缓冲液溶解CS，观察pH值对CS-KGM共混物溶胶黏度的影响。试验在共混比例7∶3、总质量浓度1.2 g/100 mL的条件下，考察pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0时共混物黏度性能，结果见图4。

由图4可知，在pH 6.0～8.0范围内，共混物黏度呈先增加后降低的趋势，在pH值处于7.0～7.5时黏度为最大值。CS-KGM共混溶胶黏度变化，主要与CS的溶解度和两共混物的大分子基团（例如氨基和羧基）的离子化程度相关［22］，当pH 6.0时，CS不完全溶解，CS-KGM共混溶胶有部分CS小颗粒，随pH值的升高，CS的溶解度增大，到达pH 7.0后CS完全溶解，二者间的交互作用更明显，黏度达到峰值。而当pH值大于7.5后，黏度开始降低，这可能是随着体系—OH的增加，胶液内部分子所带的净电荷过多，分子链间排斥力增大，阻碍了CS与KGM的相互作用，进而导致黏度下降。此结论与林好等［11，23］对KGM-明胶复配胶液的研究结果一致。为此，选pH值为7.0左右来进行后期优化试验。

2.2.4反应温度对CS-KGM共混物黏度的影响

食物中的大分子物质在共混、交联过程中，反应温度会对CS与KGM的相互作用起到很大影响［24］。试验固定共混比例7∶3、总质量浓度1.2 g/100 mL、pH 7.0、加热时间45 min（由预实验得）的条件下，探索反应温度在25、40、50、60、70、80、90 ℃条件下的共混物黏度，结果见图5。

图 5　反应温度对CS-KGM共混溶胶黏度的影响Fig.5　Effects of reaction temperatures on viscosity of CS-KGM blend sol

由图5可知，随着反应温度的升高，共混物黏度呈先增加后减小的趋势，当反应温度为60 ℃时，共混物黏度达到最大。当反应温度处于25～60 ℃之间时，黏度缓慢增加，原因可能是反应温度升高促进KGM分子溶胀，与蛋白质分子展开［25］，进而使二者相互作用加强，黏度增加。当反应温度在70～90 ℃之间时，黏度迅速降低，分析原因是因为高温引起CS中蛋白质分子的变性及KGM降解［26］，使其分子结构和特性发生变化，分子间相互作用减弱，体系黏度下降。为此，选择反应温度为60 ℃左右来进行后期优化试验。

2.3响应面分析法优化CS-KGM共混溶胶制备工艺

2.3.1响应面试验设计及结果

响应面分析为优化试验中常用的优化方法，其原理为将体系的响应值作为一个或多个因素的函数，运用图形技术将这种函数关系表示，以便直观观察试验设计中的最优化条件。采用三因素三水平Box-Behnken试验设计，综合单因素试验结果，以CS-KGM共混物黏度为响应值，选择对共混物黏度影响较大的共混比例、pH值、反应温度进行响应面分析，因素水平确定以单因素试验分析结果为依据，响应面优化试验方案及结果见表2。

表2　响应面试验方案及结果Taabbllee 22 　Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.3.2回归模型建立及显著性检验

利用Design-Expert软件对表中的试验数据进行二次多项回归拟合，获得CS-KGM共混溶胶黏度的回归方程：

按此回归方程建立响应值的方差分析（表3）及响应面（图6）。从表3可以看出，该模型回归极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＞0.05），R2Adj为0.992 4，这表明该模型的拟合度较好，能很好地分析和预测CS-KGM共混物黏度随制备条件的变化情况，较低的离散系数（CV=4.0%）也说明整个试验具有较好的精确度和可靠性；从各因素影响程度分析，各因素F值可反映出各因素对试验指标的重要性，F值越大表明对试验指标的影响越大，结合表3得出共混物黏度值影响程度的大小顺序：pH值＞共混比例＞反应温度。CS-KGM共混物黏度的响应面见图6，也可以看出响应值随着共混比例及pH值的变化幅度较大，而反应温度对响应值的影响较小，且各因素间的交互作用均显著：各因素固定水平为0水平，固定总质量浓度1.2 g/100 mL。从图6a可以看出，当反应温度固定，pH值较低水平时，随KGM比例的增加共混物的黏度越来越大，二者交互作用明显；从图6b可以看出，pH值固定时，反应温度和共混比例的变化同步，当反应温度和共混比例最大时出现黏度最大值，二者交互作用明显；从图6c可以看出，当共混比例固定时，随pH值和反应温度变化，共混物的黏度变化不大。

图 6　各因素交互作用对CS-KGM共混物黏度的影响Fig.6　Effects of interaction between two factors on viscosity of CS-KGM blend sol

2.3.3回归模型的验证

利用Design-Expert软件，通过对回归方程求解，得CS-KGM共混溶胶黏度的最大值为35.12 Pa·s，此时的制备工艺参数为KGM-CS质量比6∶4、反应温度60 ℃、pH 6.5。为了进一步验证回归方程的准确性和有效性，在最佳制备条件下CS-KGM共混溶胶，并进行黏度测定，测定值33.63 Pa·s与预测值35.12 Pa·s相近，可见回归模型能很好地预测CS-KGM共混溶胶的黏度性能，优化结果可靠。

2.4CS-KGM共混溶胶稳定性实验结果

多糖-蛋白共混体系为常见的热力学不相容体系，在加工与贮运等实际应用中常出现相分离现象，这阻碍了多糖-蛋白产品在食品、材料及药品等领域的应用［2，27-28］。故通过对比在室温25 ℃条件下响应面优化前、后共混物分层时间的先后情况来探讨共混物的稳定性。优化前共混物制备条件（普通制备条件）：总质量浓度1.2 g/100 mL、KGM-CS共混比例5∶5、pH 6、反应温度25 ℃；优化后共混物制备条件：总质量浓度1.2 g/100 mL、KGM-CS共混比例6∶4、pH 6.5、反应温度60 ℃。

图 7　CS-KGM共混物响应面优化前后稳定性对比Fig.7　Stability comparison between optimized and original CS-KGM blend sol

从图7可以看出，在实验前1～3 d内，优化前、后共混物均未出现相分离现象；在实验第4天，优化前共混物底部开始出现小范围的分层现象，而此时优化后共混物并未出现肉眼能观察的相分离现象；在实验第5天，优化前共混物已经出现大范围的絮状物、分层现象，而优化后共混物仅底部出现小范围的相分离现象。根据实验结果显示优化前溶胶在第4天时出现相分离，优化后溶胶在第5天时出现相分离，故推断优化后共混物贮藏稳定性比优化前稳定性高。

33　结 论

采用单因素试验及响应面分析法对CS-KGM共混物制备工艺条件进行优化，并建立拟合度良好的数学模型；其最佳优化工艺条件为：总质量浓度1.2 g/100 mL、KGM-CS共混比例6∶4、反应温度60 ℃、pH 6.5。在优化工艺条件下制备共混物，其黏度的实际测定值33.63 Pa·s，与预测值35.12 Pa·s相近，模型预测效果良好。同时优化后CS-KGM共混物贮藏稳定性较优化前显著提高。本研究将对提高可食性CS-KGM共混膜、高纤维型奶制品稳定性及多糖-蛋白共混原料的优化制备等方面为提供相关理论支持。此外，各制备因素对CS-KGM共混物黏度影响的机制以及CS-KGM相互作用力变化规律尚不明确，有待进一步研究，以期从分子层面反向调控CS-KGM共混物优化制备与提高稳定性。

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Optimization of Preparation Process for Casein-Konjac Glucomannan Blend Sol and Its Stability

FAN Qiao， CHEN Hourong， XU Xiaoping， TIAN Meiling， ZHANG Fusheng*
（College of Food Science， Southwest University， Chongqing400715， China）

With the aim to improve the stability of protein-polysaccharide blends and to broaden their application in the food industry， we investigated the effects of the preparation parameters （substrate concentration， blending proportion， pH and temperature） on rheological characteristics of casein-konjac glucomannan （CS-KGM） blend sol and optimized blending proportion， pH and temperature based on sol viscosity by using response surface analysis. The results of response surface analysis showed that when the total substrate concentration was 1.2 g/100 mL， all three selected parameters had signifi cant effects on sol viscosity and were optimized as follows: a KGM-CS ratio of 6:4， 60 ℃ and pH 6.5. Experiments conducted under these conditions gave a viscosity value of 33.63 Pa·s， which was closed to the predictive value （35.12 Pa·s）. In addition， a comparative study of storage stability was also carried out， and the results showed that the phase separation times of the optimized and original samples were 4 and 5 days， respectively. This study indicated that the stability of optimized sol was signifi cantly higher than that of the original one.

konjac glucomannan； casein； rheology； response surface methodology； stability

TS219

A

1002-6630（2015）24-0010-06

10.7506/spkx1002-6630-201524002

2015-04-09

国家自然科学基金青年科学基金项目（31301599）；西南大学博士基金项目（SWU111067）

樊巧（1990—），女，硕士研究生，研究方向为食品化学。E-mail：fanqiao1990@163.com

张甫生（1983—），男，讲师，博士，研究方向为食品非热加工。E-mail：zfsswu@163.com