体外细胞转化的应用及其影响因素

郑晓彤，陈薛钗，贺帅，钟儒刚

（北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市环境与病毒肿瘤重点实验室，北京100124）

癌症由于其快速增长的发病率及高死亡率，已经成为人类生命健康的重大威胁，在世界上引起了广泛的关注和重视。在人类日常接触的约6万种化学和生物性因子中，除了已被国际癌症研究署（IARC）确定的Ⅰ和Ⅱ类致癌物外，还有很多是可疑或未知的人类或动物肿瘤启动剂或促癌剂。在过去30年中，全球患肿瘤人数已经翻了一倍，而我国每年新发癌症病例约有三百多万[1]。因此如何快速筛选并鉴定出这些物质的致癌活性，对预防癌症至关重要。

目前常用的哺乳动物致癌实验有小鼠皮肤肿瘤诱发试验、小鼠肺肿瘤诱发试验、大鼠肝转变灶诱发试验、雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验等，但是试验周期长，需利用大量实验动物。基于此，体外细胞转化系统的建立为肿瘤病因学、肿瘤发病机制及其防治措施的研究提供了一个良好的实验模型和有力的技术手段[2]。体外细胞转化系统概念最早由Berwald等[3]提出，他们用碳氢化合物处理二倍体小鼠成纤维细胞，可得到具有癌变性质的多层细胞克隆。1966年，Borek等[4]首先应用X 射线成功诱发二倍体地鼠成纤维细胞恶性转化。1977年，日本学者Kakunaga[5]首先应用甲基硝基亚硝胍（MNNG）和4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）体外诱发正常妇女口唇皮肤组织二倍体成纤维细胞恶性转化。此时，体外细胞转化系统开始逐渐形成。正常细胞经过适当刺激后发生细胞形态及生物学特性的改变，获得接近于肿瘤细胞的性质，如呈上皮样细胞形态、排列紊乱、失去方向性、形成交叉和旋涡、失去细胞密度调节作用、染色体核型异常、可以在半固体琼脂培养基中形成集落等，这种细胞变化称为细胞转化[6]。细胞是肿瘤发生的基本单位，研究正常细胞如何演变成肿瘤细胞是肿瘤研究中的一个根本问题。体外细胞转化是从细胞生物学和分子生物学水平上研究肿瘤的发生与发展的基本技术[7]，它能够快速检测有遗传毒性的化学品在致癌中的作用，在研究肿瘤的发生、发展、防止及治疗等方面具有重要意义。

1 细胞转化

体外细胞转化非常近似地模拟了动物致瘤过程，是众多方法中较有可能替代动物实验的方法，其检测效能得到了许多研究者和包括IARC和欧洲替代方法研究中心（ECVAM）等众多机构关注。IARC根据早期数据认为体外转化与体内致癌物间具有很好的相关性，一致率达69%～85%。ECVAM对Balb/c-3T3细胞转化实验的效能参数进行了总结[8]，表明该方法与体内实验一致性为71%，灵敏性和特异性分别为80%和60%，阳性预测率为70%，阴性预测率为71%。因此，细胞转化实验能为鉴定人类可能的致癌因子提供非常有价值的信息。

1.1 细胞转化

研究显示，体外细胞转化是一个多阶段的过程：（1）在动物实验中致癌的化学物质可诱导正常细胞转化；（2）恶性转化的细胞可在敏感动物体内致瘤，而非转化细胞则不能致瘤；（3）在转染活性癌基因的实验中，正常细胞向恶性细胞发展的不同阶段会表现出多个不同的表型；（4）促癌剂可增强经低浓度启动剂处理过的细胞的转化频率[9]；（5）已在动物体内实验中确认的几种环境毒素，有90%以上可在两阶段体外细胞转化检测中得到阳性结果[10]。

1.2 细胞转化的鉴定

在判别细胞转化的标准中，通常所采用的指标有：细胞形态学及其生长状况的改变；染色体核形异常；细胞转化灶的形态；半固体琼脂培养基中形成集落的能力；以及在免疫抑制动物或裸鼠体内的致瘤能力；此外，还可通过细胞突变、ConA 凝集反应进行鉴别。

通过细胞形态学及其生长状况的变化判定细胞转化实验的结果主观性太强，而细胞转化实验在致癌物的筛选和早期抗癌药物的制备中具有重要意义，因此建立快速、简便、可靠的体外检测方法是毒理学研究中亟需解决的问题。近年来，从分子水平寻找基因标志物判定细胞转化的终点成为改进细胞转化检测方法的一个方向。Sakai[11]等利用mRNA 差异显示方法发现转化时7个上调基因和7个下调基因，其中有5个为促癌剂TPA和岗田酸共有的改变。Maeshima[12]等利用基因芯片技术，鉴定出22种细胞转化的基因标志物。这22种基因参与细胞周期、转录调节、抗细胞凋亡和细胞分裂正调节。基因标志物与细胞转化实验的结果具有相关性，表明以基因标志物为基础的细胞转化实验技术可能成为促癌物筛选的有效方法。此外王颖[13]等成功建立了Bhas 42细胞转化试验的H2O2法并实现了高通量检测，使细胞转化实验的周期缩短且提高了结果的准确性。随着研究的不断深入和改进，细胞转化实验能在致癌物的筛选、抗癌新药的研制和药物毒理学的验证等方面发挥更加重要的作用。

2 细胞转化的应用

2.1 检测物质的致癌潜力

细胞转化实验具有检测各种类型致癌物的潜力，包括基因毒性和非基因毒性致癌物。然而，目前用于评估的数据存在着致癌物和非致癌物数量不均衡问题，需增加非致癌物检测数据，以提高特异性值可靠性。另外，还需增加数据库中被检测化学物的数量，以使评估数据更加准确。细胞转化实验方法最初建立的目的是从人类接触的环境致癌物中筛选出可能具有致癌活性的物质[14]，早期的方法仅能用于启动剂的检测，主要为基因毒性致癌物；后来发展起来的两阶段转化方法使其还可以用于促癌剂的筛选，及药物对细胞的作用等方面。细胞转化实验的终点与体内肿瘤的形成十分接近，因而它是用来测试化学致突变物和致癌物的重要实验方法。

2.2 检测致癌因子间的相互作用

细胞转化实验也可被应用到多种致癌因子间相互作用检测。检测发现某些不具有致癌性，有时甚至可能具防癌作用的物质，在与致癌物相互作用时反而具协同促癌作用。Perocco[15]等在检测十字花科蔬菜中水田芥甙对苯并[a]芘（B[a]P）促转化作用影响时发现，具防癌作用的水田芥甙单独作用时并不具促转化作用，但与B[a]P共同作用时却能使B[a]P的致癌活性增加约7 倍。具相同作用的还有β-胡萝卜素，可显著加强由B[a]P和香烟冷凝物引起的细胞恶性转化[16]。王李伟[17]等利用Balb/c 细胞转化方法发现三羟异黄酮也具加强B[a]P引起的细胞转化作用。这种协同作用均发生在营养物质与B[a]P联合作用上，具体机制可能与细胞色素氧化酶系激活有关，该酶系是B[a]P代谢为终致癌物的关键。而已经是终致癌物的MCA 对Balb/c-3T3 细胞的转化作用则不受β-胡萝卜素的影响。

2.3 筛选抑癌物

细胞转化实验亦逐渐被用于抑癌物的筛选。Tsuchiya[18]等在促癌阶段应用抗坏血酸及其衍生物，观察它们的抑癌作用。结果表明，抗坏血酸及其衍生物可以显著抑制TPA、二癸酸佛波酯和肿瘤坏死因子对细胞转化的促进作用。而β-胡萝卜素对苯并[a]芘及香烟气冷凝物的协同促转化作用则可被维生素E和α-萘黄酮所抑制[19]。Tsujino[20]等采用Balb/c-3T3细胞研究新型人工合成无环视黄醇NIK/333的抗癌作用，发现其与全反式维甲酸有相似的抑制作用，并发现Balb/c-3T3细胞具有类维生素A 受体，可提高细胞间隙连接通讯水平。解瑞宁[21]等则利用Balb/c -3T3 细胞发现番茄红素可以阻止苯并(a)芘诱导的细胞转化作用，且维生素E 的存在能增强番茄红素的抗转化作用。Nishikawa[22]等首次报导了增补铂纳米颗粒的电解还原水可以在促癌阶段抑制细胞的恶性转化，从而发现一种新的具有抗癌功能的抗氧化剂。

综上所述，细胞转化实验是检测物质致癌活性的重要方法。最近的研究发现细胞转化实验还可用于研究癌症中microRNA表达使耐药性产生的机制[23]。细胞转化实验在基础研究中发挥了重要作用。

3 细胞转化的影响因素

致癌因子的范围很广，化学因子包括多环芳烃、烷化剂、金属化合物及芳香胺类等物质，物理因子包括辐射，生物因子有病毒等。致癌物作用后能否引起细胞转化、转化率高低和潜伏期的长短等还要受其它内、外因素的影响。

3.1 细胞系的选择

细胞在体外生长过程中，其生物学特性要稳定，细胞对致癌因子的作用反应要敏感；细胞本身自发转化率要低；对外界影响细胞转化的因素要明确；应是正常细胞。目前国内外常用于体外细胞转化实验的细胞系主要有三种：（1）金黄地鼠胚胎细胞（GHE）、肾细胞或乳鼠肺细胞等；（2）小鼠胚细胞、成纤维细胞、前列腺细胞等；（3）大鼠胚胎细胞、肺成纤维细胞、气管上皮细胞、肝上皮细胞等。

靶细胞还可以分为原代培养细胞和传代培养细胞。原代培养细胞的代表是叙利亚地鼠的胚胎成纤维细胞（SHE）。该细胞容易制备和培养，自发转化率较低，转化后容易识别并能以定量的方式获得数字结果。此外，它的测试周期较短，具有代谢多种化学致癌物，使其成为终末致癌物的能力，比较适于检测环境中的各种可疑致癌物。但亦有研究表明，该系统对环境中的易变因素过于敏感，如容易受到小牛血清的不同来源和特定胚胎细胞池的影响[24,25]；另外，它的细胞群是异质的，在无饲细胞层的条件下，克隆形成率较低。传代细胞系是原代培养细胞经首次传代成功后获得的细胞系，也可细分为有限细胞系和连续细胞系[26]。常用的Balb/c-3T3、 C3H10T1/2 和BHK-21均为连续细胞系。

传代细胞系较原代培养细胞系具有细胞群落稳定性高，试验重复性良好，剂量反应关系明显等特点[27]，常用于实验研究。由于人类癌症约70% 来自上皮细胞，因此以上皮细胞作为靶细胞更具备实际意义。但上皮细胞建系困难，而且转化细胞的判定标准不如成纤维细胞那样明确，因此对于转化实验体系的优化尤为迫切[28]。

3.2 其它影响因素

细胞转化还要受其它因素的制约：（1）受细胞来源的影响。与供体的种属有关，小鼠、金黄地鼠胚胎细胞对化学致癌物致癌作用很敏感，而人的成纤维细胞则不敏感[29]；（2）与细胞性质相关。细胞分化程度与转化潜伏期长短呈负相关，如妊娠12天的鼠胚细胞和20个月月龄金黄地鼠皮肤成纤维细胞诱发转化的潜伏期分别为20.3和10.8 个细胞群体倍增时间（TD）。间质细胞较上皮细胞敏感，后者细胞转化率低，潜伏期长[30,31]，可长达4 个月或更长；（3）受培养条件变化的影响。培养基内血清浓度降低，则细胞转化率降低。在有滋养层细胞存在时，细胞转化率提高。培养温度降低(如由37℃ 降到32℃)、加入两性霉素和长期缺氧则可使己转化的细胞失去转化细胞的生物学性质[32]；（4）与化合物对细胞作用的方式相关。多环芳香族碳氢化合物很快与靶细胞DNA 、RNA 和蛋白质结合，特别是与细胞核DNA 的结合[33]。DNA链结构受损，引起细胞遗传信息改变，细胞首先发生突变，进一步染色体畸变和新型核组出现。在致癌物作用下，在前5～10 代细胞可发生突变，传代至50～150个TD后能在软琼脂培养基中生长、增殖，形成细胞集落的转化细胞在动物接种后可达100%恶性肿瘤形成率。胞浆内RNA、蛋白质等的改变在细胞转化方面不起关键作用。如用3H-TdR和氖一尿嘧啶核苷（3H-U）分别掺入到胞核DNA和胞浆RNA 、蛋白质内，只有3H-TdR才能引起细胞突变和转化[34]。

4 结语

细胞转化实验作为筛选致癌物一种有效方法已被广泛地应用，然而构建更加稳定敏感的细胞系，客观和精准的检测指标和检测手段仍需进一步研究。人体细胞是最为理想的转化实验靶细胞，然人体细胞化学物质转化最终形成癌细胞是一个相当复杂的过程，无法用常规方法筛选。因此在这方面进行更深入地研究将有助于学者发现未知的潜在致癌因子，进一步探知癌症的致病机理，为药物毒性的检测提供一个强有力的手段。随着分子生物学与生物化学、遗传学及免疫学等学科的交叉发展，细胞转化实验将在研究肿瘤的发生、发展、防止及治疗等方面发挥重要作用。

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