自噬及其与肿瘤生长、侵袭、治疗的关系

史善伟 李一

口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院头颈肿瘤外科（四川大学），成都 610041

自噬（autophagy）是真核细胞中一种高度保守的细胞生物学行为，是细胞的自体吞噬、消化的过程，其中细胞通过双层膜结构包裹细胞内的胞浆和小细胞器，并运送到溶酶体中进行代谢，为细胞提供营养物质和能量，维持细胞的代谢平衡，缓解应激压力[1]。自噬可被分为基础状态下的自噬和诱导状态下的自噬，基础状态下的自噬代谢速率较低，主要通过清除有聚集倾向的蛋白质和损伤的细胞器来维持细胞内环境的稳态[2]。在低氧、营养匮乏等不利微环境的诱导下，细胞通过激活、上调自噬水平来降解细胞内蛋白聚集体、氧化脂质、受损细胞器等物质来维持细胞存活[3]。

自噬是一种复杂的生理现象，根据底物进入溶酶体的途径不同可分为三种类型：巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediate autophagy，CMA）。巨自噬（通常简称为自噬）是细胞内大分子物质和小细胞器被运送到溶酶体进行降解的过程。在这个过程中，内质网和高尔基体膜被拉长，并包裹周围的细胞质或特定物质形成双层膜结构，即自噬体（autophagosome）。自噬体随后与溶酶体融合形成自噬溶酶体（autolysosome），其内包裹的物质被溶酶体内水解酶分解代谢，形成小分子物质（如氨基酸、核苷酸等）又被细胞重新利用[4]。微自噬是溶酶体膜随机内陷包裹周围细胞质的一种非选择性的溶酶体降解过程[5]。分子伴侣介导的自噬仅存在于哺乳动物中，是细胞内的分子伴侣蛋白，如热休克蛋白70（heat shock cognate protein 70，HSC70），与有特定序列的可溶性蛋白底物结合，最后被运送到溶酶体内降解的过程，该过程具有一定的选择性[6]。本文主要就巨自噬这一细胞内主要的自噬类型与恶性肿瘤的发生过程进行探讨。

1 调控自噬的信号通路

1.1 Beclin 1

哺乳动物的Beclin 1与酵母菌Atg6/Vps30是同源基因，其编码的Beclin 1蛋白对自噬的调控具有重要的作用。Beclin 1与多种因子（Atg14L，UVRAG，Bif-1，Rubicon，Ambra1，HMGB1，nPIST，VMP1，SLAM，IP3R，PINK）共同作用来调节脂质激酶Vps34蛋白，促进Beclin 1-Vps34-Vps15核心复合物的形成，从而影响细胞的自噬活性[7]。在这一过程中，Ⅲ类PI3K激酶复合物是调节作用的核心调控因子，其包括Vps34/PI3KC3催化亚基、Vps15/PI3KR4调节亚基和Beclin 1、UVRAG、Atg14L、Rubicon蛋白[8]。其中Atg14L与Beclin 1的CCD结构域结合形成的Beclin 1-PI3KC3复合体能激活Vps34，从而使LC3蛋白聚集和吞噬泡膜延长，促进自噬体的形成。紫外线放射抵抗蛋白（ultraviolet radiation resistance-associated gene protein，UVRAG）与Beclin 1的CCD结构域结合形成的Beclin 1-PI3KC3-UVRAG复合体可以激活Ⅲ类PI3K激酶复合物的活性，促进自噬体的成熟。而Rubicon作为UVRAG的亚单位与Beclin 1结合，反而能抑制自噬体的成熟[9]。通过酵母菌的双杂交系统，研究者发现Beclin 1蛋白的BH3结构域可与抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-W、Bcl-XL相互作用。在乳腺癌中，Bcl-2的过度表达能抑制癌细胞的凋亡，Bcl-2也能通过与Beclin 1的BH3结构域结合来抑制Beclin 1-Vps34复合物的形成，从而削弱了Ⅲ类PI3K的作用，抑制细胞的自噬活性[10]。在营养缺乏的条件下，Beclin 1与Bcl-2或Bcl-XL的结合受到抑制，可以激活细胞自噬活性。因此，Beclin 1与不同的蛋白分子结合对自噬体的形成和成熟产生不同的作用。

1.2 雷帕霉素受体

雷帕霉素受体（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，在癌细胞中起下调自噬的作用。mTOR可以与多种蛋白质结合形成两种不同的复合物：雷帕霉素受体复合物1（mTORC1）和雷帕霉素受体复合物2（mTORC2），其中mTORC1在细胞自噬的负调节中起主要作用。在调节mTORC1的三条信号通路中，Ras原癌基因通路和Ⅰ类PI3K-AKT通路具有激活mTORC1的作用，而肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）、AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）则有抑制mTORC1的作用[11]。肿瘤细胞中的抑制基因PTEN常发生突变或缺失，PTEN基因的突变或缺失可引起AKT的激活，AKT能够通过磷酸化TSC2激活mTORC1的结合蛋白PRAS40，使其与mTORC 1解离从而激活mTORC1[12]。研究发现，生长因子可以激活Ⅰ类PI3K复合体和GTPase Ras，从而激活Ⅰ类PI3K-AKT通路，致使TSC1/TSC2磷酸化来激活mTORC1[13]。在低氧、营养匮乏等应激条件下，细胞内ATP水平降低而AMP/ATP的比值升高，从而激活抑癌基因LKB1，导致AMPK活化，AMPK激活可以通过磷酸化TSC2来抑制GTPase Rheb，并下调mTORC1的功能[11]。肿瘤抑制基因p53突变也可以通过激活AMPK来抑制mTORC1的活性。在mTORC1的下游调节通路中，mTORC1的激活能促进哺乳动物自噬相关蛋白13（mammalian autophagy related protein 13，mAtg13）与ULK的结合，并通过磷酸化ULK1复合体来抑制自噬体的形成，从而抑制自噬活性[14]。

2 自噬的测量

真核生物细胞中自噬的检测和定量分析对研究自噬对真核生物生长发育的影响和自噬与疾病的关系有重要作用。目前，对自噬体的测量主要有三种方法：电镜观察、Western免疫印迹技术和LC3免疫荧光显微镜技术。自噬体在超微结构下被定义为包含未被消化的细胞质或小细胞器（如线粒体，部分内质网），且未与溶酶体融合的双层膜结构。利用电镜观察自噬体的结构可以对自噬体从早期到晚期的体积进行定性或定量测量[13]。细胞自噬是一个动态过程，对自噬体数量的测量只能描述自噬过程中的某一静态瞬间，而不能反映其整体的动态活性。基于这一缺陷，自噬潮（autophagic flux）这一概念被引入，用于描述自噬活性，其是指底物被自噬体包裹后运送到溶酶体内降解并重新利用的整个过程，主要通过微管相关蛋白1的轻链3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）在不同条件下的浓度变化进行描述。在自噬过程中，LC3首先切除C端的氨基酸转化成为散布于胞浆内的LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ再与磷脂酰乙醇胺（phosphatidyl ethanolamine，PE）结合形成稳定存在于自噬体内膜和外膜上的LC3-Ⅱ从而在细胞自噬的整个过程中发挥重要的调控作用[15]。LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于前自噬泡和自噬泡表面，在哺乳动物自噬泡形成过程中，LC3在协同由Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12参与组成的泛素样蛋白加工修饰过程中起重要作用，其表达和LC3-Ⅰ至LC3-Ⅱ的转化程度成为自噬水平的重要标志[16]。因此，免疫荧光蛋白LC3（green fluorescent protein- LC3，GFPLC3）可以作为细胞内检测自噬体的特异标记物。细胞中LC3水平升高可能是由于自噬活性的增加导致，也可能是由于自噬体在后期降解过程被阻滞导致，因此单纯在某一时间点测量细胞在特定药物作用下的LC3含量并不能准确反映细胞的自噬活性。实验中通常需要测量细胞基础自噬与自噬阻滞条件下的LC3含量差别来准确反映细胞自噬的动态活性。广泛使用的自噬抑制剂是氯喹（Chloroquine）、巴弗洛霉素A1（Baf ilomycin A1）或溶酶体蛋白酶等，通过阻断自噬体与溶酶体的融合，导致自噬体的积累[17]。利用蛋白免疫印迹技术和免疫荧光显微镜技术检测目标细胞与正常细胞基础水平下LC3的含量，可以反映细胞的自噬活性，对诱导状态下自噬潮的测量可反映出细胞的自噬潜力。近年来，除了LC3，p62蛋白检测亦被用于自噬水平评价中。p62/SQSTM1是一种多功能蛋白，参与多种信号传导通路（包括凋亡和细胞自噬），其包含与LC3蛋白结合的结构域，二者的结合物进入自噬溶酶后被降解，如果自噬被抑制，SQSTM1水平则上升。p62/SQSTM1的水平与基础自噬水平成负相关关系，可以利用细胞免疫组织化学、染色、蛋白免疫印迹法和GFP标记方法对p62进行连续测量来反映自噬的活性[18]。

3 自噬与肿瘤

自噬在肿瘤发生、发展、转移的过程中具有“双刃剑”的作用。首先，在肿瘤发生的前期，自噬可以通过清除正常细胞内受损线粒体、过氧化物酶体及其他细胞毒性物质来维持细胞内稳态，抑制癌基因的激活，防止肿瘤的发生[4]。其次，在已经恶性转化的癌细胞中，自噬通过再循环作用，为癌细胞的生存提供营养物质，从而维持癌细胞的存活，并能促进恶性肿瘤的增殖和侵袭转移[19]。

3.1 自噬对肿瘤的抑制作用

在哺乳动物体内，病原体和细胞毒性物质的刺激可以使机体产生慢性炎性损伤，而慢性炎症环境又可以激活癌基因，导致肿瘤发生[20]。Beclin 1等位基因缺失能引起p62的积累并抑制核转录因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路，从而引起细胞坏死，并能使Kupffer巨噬细胞聚集，引发炎症反应，最终导致肿瘤的发生[21]。细胞内的自噬作用可以清除过量积累的p62，防止细胞坏死引起的炎症，从而预防肿瘤的发生。在应激条件下，细胞内线粒体损伤，可导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累，造成DNA损伤[22]。自噬既能清除细胞内损伤的线粒体，防止ROS的积累，维持染色体的稳定；又能够通过分解代谢作用为DNA修复提供必需的核苷酸[2]。因此，自噬可以通过维持细胞内染色体的稳定，防止癌基因激活，预防肿瘤的发生。自噬也能促进机体的免疫应答反应，清除肿瘤相关病毒和肿瘤细胞，从而达到对肿瘤的抑制作用。研究发现，抗原呈递细胞中的自噬反应能够影响多种细胞因子的释放，从而在细胞死亡之前激活免疫应答反应；同时，自噬也能激活骨髓淋巴细胞并维持骨髓淋巴细胞的存活，因此，自噬在先天性免疫应答反应中具有重要的作用[23]。从免疫学角度，肿瘤细胞必须通过失去抗原特性或者抑制免疫应答反应来逃避免疫监控从而得以存活，肿瘤细胞的自噬可以激活并增强MHCⅠ类和Ⅱ类分子对抗原的呈递和对CD4+T细胞的活化，增强细胞的免疫应答反应，从而增强机体清除肿瘤细胞的能力，预防肿瘤的发生[24]。综上所述，自噬能通过抑制机体内的炎症反应，维持染色体稳定和促进机体免疫应答反应等途径来抑制肿瘤的发生。

3.2 自噬对肿瘤的促进作用

3.2.1 自噬有利于肿瘤细胞的存活和增殖 肿瘤微环境主要由癌细胞、非恶性上皮细胞、成纤维细胞、血管、免疫细胞和细胞外基质等组成，这些因素相互作用，对肿瘤的发生、增殖和转移具有重要的作用。自噬作为肿瘤细胞生存的重要机制，可以在肿瘤细胞和肿瘤微环境之间起调节作用。研究发现，在低氧和营养缺乏的环境下，肝肿瘤干细胞CD133+细胞能够通过激活自噬来维持细胞存活[25]。缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIF）-1α和-2α是细胞适应低氧环境的主要转录调节因子。在低氧情况下，HIF因子激活编码葡萄糖转运和糖酵解酶基因的转录，而后者能抑制Bcl-2和Beclin 1的结合，促进Beclin 1激活细胞的自噬来清除损伤线粒体，减少ROS产生[26]。

肿瘤细胞通过自噬分解代谢作用产生营养物质和能量来维持肿瘤细胞的生存，并缓解外界环境对肿瘤细胞的应激压力。自噬最初是在酵母菌应对饥饿时发现的，酵母菌通过自噬维持氨基酸水平和上调线粒体功能来支持饥饿条件下酵母细胞的存活[27]。自噬在低氧区域的肿瘤细胞中非常突出，如果敲除重要的自噬相关基因，可导致低氧区域的肿瘤细胞发生死亡[28]。此外，Ras致癌基因的活化，可诱发肿瘤的生长，这些肿瘤细胞通过上调自噬水平来提高在应激环境下的生存能力[29]。研究发现，雄激素可以通过上调自噬，增加前列腺肿瘤细胞内的脂质水平来促进前列腺癌细胞的生长[30]。线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，并为细胞的生命活动提供能量，自噬作用可以使肿瘤细胞在低氧等应激条件下保持线粒体的功能，从而为肿瘤细胞的增殖提供充足的能量。

3.2.2 自噬有利于细胞的侵袭、转移 肿瘤休眠是恶性肿瘤细胞的生物特性之一。肿瘤细胞的休眠作用一方面可以使肿瘤逃避手术和放疗的打击，在休眠细胞重新激活增殖后导致肿瘤复发，另一方面也可以保持肿瘤转移时的细胞活性[31]。自噬能使休眠的肿瘤细胞抵抗细胞凋亡，对其生存有重要的保护作用。乳腺癌细胞向骨髓转移时，癌细胞会在骨髓中以休眠的形式存活一段时间，而骨髓微环境中有大量肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand，TRAIL），TRAIL可以通过T细胞和NK细胞介导肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤的转移，最近研究发现，肿瘤细胞中自噬水平的上调可以抑制TRAIL，从而保护休眠的肿瘤细胞[32]。在卵巢癌和消化道间质瘤的转移肿瘤细胞中，肿瘤抑制基因ARHⅠ（aplasia ras homolog member Ⅰ）能激活自噬，并促进肿瘤细胞休眠，但如果ARHⅠ的表达水平下降，休眠的肿瘤细胞就会恢复增殖潜能并迅速生长[33]。如果抑制ARHⅠ介导的自噬，则能显著降低种植转移肿瘤细胞的再生长，从而证明，自噬对休眠细胞的存活和再生长具有重要作用[34]。

正常细胞与细胞外基质失去接触会诱发细胞的程序性死亡，即失巢凋亡。细胞的失巢凋亡能维持机体的生长发育和自身平衡，如小鼠可以通过这一过程清除其乳腺导管形成过程中基底膜上脱落的上皮细胞[35]。肿瘤细胞通过特殊的蛋白质附着于宿主细胞或细胞外基质上以保持其生理活性，在向远处转移的过程中必须激活抗失巢凋亡机制来维持细胞的存活。肿瘤细胞在脱离细胞外基质后，β1整合素信号通路受到破坏，而细胞脱离细胞外基质或β1整合素信号通路阻滞均可激活细胞自噬[36]。自噬可以使脱离细胞外基质的肿瘤细胞通过重新代谢作用为自身提供营养物质以维持其生存。在肿瘤细胞转移过程中，自噬可以保护肿瘤细胞通过脉管系统，并在远处附着生存[37]。自噬对失巢凋亡的抑制作用可以使恶性肿瘤细胞在侵袭转移过程中存活下来，并使肿瘤细胞在宿主细胞或细胞外基质环境中得以生存。但自噬的抗失巢凋亡机制尚不清楚。

上皮—间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞经过特定程序促使其黏附分子表达减少，细胞骨架的主要构成由角蛋白转化为波形蛋白，最终使上皮细胞转变为间充质细胞表型的过程。上皮性肿瘤细胞在EMT转化过程中，细胞极性和细胞间黏附性丧失，使细胞获得以迁移、浸润为特点的特殊表型，从而导致肿瘤细胞的播散[38]。肝细胞癌HepG2和BEL7402的细胞自噬经饥饿诱导后能抑制上皮细胞标志物的表达，促进细胞间充质标志物的表达及上皮—间充质的转化，从而促进肝细胞癌的侵袭和转移。但经氯喹和Atg3或Atg7对肝细胞癌的自噬抑制处理后，肝细胞癌的EMT和侵袭性均受到抑制。EMT在转化过程中能使Beclin 1重新表达，激活细胞自噬。乳腺癌细胞可通过EMT和自噬的协同作用共同抵抗细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocytes，CTL）的杀伤作用[39]。EMT在改变肿瘤细胞表型的过程中能通过诱导自噬作用来使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的监测。

微泡分泌是细胞内包含蛋白质的多泡体（multivesicular bodies，MVBs）与细胞膜融合后释放到细胞外的过程，可以以信号因子的形式进行细胞间的信号传递。细胞内多泡体的代谢有三种方式：1）MVBs与溶酶体融合而被降解；2）在病理性刺激下，MVBs能与细胞膜融合，其内的蛋白质作为主要组织相容性复合物Ⅱ类分子（major histocompatibility complex Ⅱ ，MHC-Ⅱ）于细胞膜的表面表达；3）MVBs分泌到细胞外，并以微泡分泌的形式进行细胞间的信号传递。微泡分泌对肿瘤细胞的免疫调控起重要作用。B细胞的微泡分泌可以以抗原呈递的的方式激活CD4+T细胞，同时，树突状细胞和肿瘤细胞的微泡分泌过程都具有激活体内抗肿瘤免疫反应作用，能有效地抑制肿瘤的侵袭转移。因此，微泡分泌在肿瘤的免疫治疗领域中受到广泛关注。在K652细胞微泡分泌的研究中发现，MVBs参与自噬的形成过程，并且在使用聚焦显微镜中发现细胞中MVBs过度表达Rab11蛋白和LC3蛋白，Rab11蛋白对自噬体与MVBs的融合起重要作用，而自噬的诱导也可以导致LC3蛋白过度表达，并使MVBs参与到自噬形成的过程中，从而能抑制微泡分泌[40]。网织红细胞在成熟过程中，一些废弃的膜蛋白和细胞器被释放到MVBs中，从而被运送到体外，而这些膜蛋白和细胞器也可以通过自噬的分解代谢作用被消化，因此，在形态学和分子生物学的研究中发现，自噬体先与MVBs融合，然后再与溶酶体融合，从而抑制细胞的微泡分泌[41]。肿瘤细胞的自噬可以通过抑制微泡分泌，来降低机体对肿瘤细胞的免疫监测功能，从而促进肿瘤的侵袭转移能力。

4 自噬与肿瘤的治疗

自噬在肿瘤发生、发展的不同阶段中有不同的作用，因此自噬在肿瘤的治疗过程中也发挥着不同的作用，正确利用自噬作用可以有效的提高疗效，延缓肿瘤复发，但对肿瘤细胞的自噬利用不当，就会产生不良后果。通过抑制或激活肿瘤细胞的自噬进行个体化治疗是当今研究的一个热点。

4.1 抑制自噬在肿瘤治疗中的作用

肿瘤细胞的自噬可以降低放疗、化疗对肿瘤的治疗效果，因此可以通过抑制自噬来提高肿瘤细胞对放疗、化疗的敏感性，从而提高肿瘤的治疗效果。自噬抑制治疗已经在神经胶质瘤、骨髓瘤、乳腺癌、直肠癌、前列腺癌等多种肿瘤的治疗中被证实有效[42]。研究[43]发现，自噬阻滞剂氯喹及其衍生物羟氯喹与DNA烷化剂环磷酰胺结合能够明显地增加肿瘤消退率，而且可以显著延缓肿瘤的复发。同时，氯喹和羟氯喹在肿瘤的放疗和化疗中具有协同作用。

在口腔鳞癌患者预后的研究中发现，LC3高表达患者的预后比LC3低表达患者的预后差[44]，相同的研究[45]也表明，抑制口腔鳞癌基础水平的自噬可增强口腔鳞癌化疗的敏感性。雷帕霉素以及Beclin 1基因均可通过调控LC3的表达，上调舌鳞癌细胞的自噬水平，从而抑制舌鳞癌的增殖、侵袭和转移能力。由此可见，不同水平的自噬对口腔鳞癌的的作用不同。目前，口腔鳞癌细胞自噬的分子调控机制以及自噬在口腔鳞癌发展不同阶段的作用仍需进一步研究。正确调控口腔鳞癌自噬水平，对口腔鳞癌的治疗和预后具有重要临床意义。

4.2 激活自噬在肿瘤治疗中的作用

虽然抑制自噬在肿瘤治疗中发挥重要作用，但也有很多肿瘤在激活自噬状态下对肿瘤的治疗有促进作用。在营养缺乏或饥饿情况下，细胞可以通过自噬的分解代谢作用产生营养物质和能量来维持细胞一段时间的生存，但自噬也可以导致细胞体积随时间而缩小，如果时间过长，就会导致细胞自噬性死亡。

对肾移植患者的回顾性研究发现，雷帕霉素对肿瘤的发生有抑制作用[46]。雷帕霉素及其类似物坦罗莫司是一种mTOR抑制剂，可以选择性的激活靶细胞的自噬。临床上雷帕霉素仅在治疗肾细胞癌、神经内分泌癌和淋巴瘤中取得成功，雷帕霉素结合细胞毒性化疗药物可以提高肿瘤细胞的死亡，从而提高抗肿瘤的疗效。

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