藏绵羊肠道乳酸菌的分离鉴定及系统进化研究

才 松

（青海省曲麻莱县巴干乡畜牧兽医工作站 815500）

乳酸菌为可发酵产生大量乳酸的一类细菌的统称，并是一种动物体内的重要益生菌。乳酸菌有助于改善机体胃肠免疫机能，并帮助机体生成维生素与正常排便，对于人畜的健康有积极作用[1]。藏绵羊主要生活在我国青藏高原地区，那里的平均海拔超过三千米，常年严寒且空气稀薄。而在这样恶劣的生存环境下，藏绵羊具有很强的适应能力，并且是高原牧民日常生活中常见的畜种。由于藏绵羊多为自然放养且生活环境恶劣，因此高原地区藏绵羊一般体形偏小，且很容易被多种疾病感染，如羊犊腹泻就是高原牧区流传较广的疾病。本次研究选择十头藏绵羊的粪便，在分离和细菌培养后进行提纯处理，探究藏绵羊肠道乳酸菌的生物学特性以及构成，以此为开发藏绵羊腹泻治疗药物提供参考。

1 材料与方法

1.1采集样品

选择生活于若尔盖草原的健康藏绵羊十头，这些藏绵羊均为天然放牧，生长发育情况良好。在无菌情况下采集这些藏绵羊的新鲜粪便，并且放置于试管中并滴注MRS液体进行培养，然后在实验室中进行进一步操作。

1.2分离与提纯

在含有碳酸钙的MRS平板上涂布含有粪便的液体培养基，然后置于三十摄氏度下进行培养，并在二十四小时候再一次涂布，保障菌群的正常生长。在培养过程中定时观察菌群的生长情况与特性，并且选择其中形态较小的菌落进行生化试验，并在革兰氏染色镜下进行检查。将经过氧化氢酶检验呈现阴性，以及经革兰氏染色呈现阳性的分离出来，然后置于MRS平板进行再次培养。在恒温情况下培养24小时候再次进行分离，重复多次以达到纯化的目的。在镜检表明菌落形态一致后，将这些乳酸菌菌株再次进行培养，并在24小时候后进行甘油保种，以此增加菌株数量。

1.3 DNA序列扩增

将对数期的菌液进行高速离心，然后得到其中的菌株提取出DNA序列，并加入适当的引物进行DNA扩增。最后通过凝胶电泳法对所得序列进行检测，判断这些片段是否正确，并收集正确的DNA片段进行测序。

1.4分子鉴定与系统进化树的构建

将所得序列与数据库中已有DNA序列进行对比，在确定乳酸菌菌株所属类别的同时，对所得序列进行对比，然后使用相关软件绘制菌株系统进化树，进而了解藏绵羊肠道乳酸菌的生物学特性以及进化情况。

2 结果与分析

2.1革兰氏染色检验情况

在分离并提纯乳酸菌菌株后，从10个样本中得到15株乳酸菌单菌，而在革兰氏染色镜检下发现均为阳性，且菌株呈现杆形或球形，为长链状或短链状排列，没有芽孢或鞭毛。

2.2 DNA扩增情况

通过对分离得到的15株乳酸菌单菌进行DNA序列测定，发现分属菌株类别有六个，分别为海氏肠球菌、植物乳杆菌、马蹄链球菌、鹑鸡肠球菌、粪肠球菌以及巴氏链球菌。

2.3菌株遗传特性分析

根据DNA序列表进行对比后构建DNA序列的进化树，结果表明：海氏肠球菌为2株，植物乳杆菌为4株，马蹄链球菌2株，鹑鸡肠球菌2株，粪肠球菌3株，巴氏链球菌2株，可见所得均为乳酸菌菌株。

3 讨论

藏绵羊为我国珍贵的原始绵羊品种，常年生活在海拔超过三千米的青藏高原地区。由于高原地区常年严寒且空气稀薄，并且藏绵羊多以自然放养为主。因此在这样恶劣的生存环境下，藏绵羊免疫力较低且体形偏小，很容易被多种疾病感染。近年来，高原地区藏绵羊发生腹泻的概率升高，这也给牧民带来严重的经济损失[2]。虽然抗生素等药物的应用能够治疗动物腹泻等疾病，并在个体疾病方面也有较好的效果。但是抗生素具有一定的耐药性，且容易导致环境污染并存在药物残留，而如何更好地预防藏绵羊等动物腹泻引起了多方面的关注。由于藏绵羊的生存环境特殊，且为绿色无污染食品，如何减少抗生素使用的不利影响，这是当前研究的重点。而乳酸菌作为动物体内的重要益生菌，对于改善机体胃肠免疫机能，保障动物健康有积极作用。因此，开发藏绵羊乳酸菌制剂是重要的研究方向。

本次研究通过采集了十头藏绵羊的粪便，在分离和细菌培养后进行提纯处理，从中得到乳酸菌株并进行分子鉴定。结果表明，得到乳酸菌单菌中所占比例较多的为植物乳杆菌、粪肠球菌等，另外也包括马蹄链球菌、鹑鸡肠球菌以及巴氏链球菌等。鹑鸡肠球菌为人畜体内的重要菌体，并且可以产生肠球菌素，进而起到抑菌的作用，促进宿主的肠道健康。而海氏肠球菌与粪肠球菌等为动物肠道内的正常菌群，能够抑制细菌的生长和繁殖，进而保障机体的正常消化功能。而植物乳杆菌这种多见于蔬菜、植物等发酵制品中的乳酸菌，对于维护肠道的正常消化吸收有重要作用[3]。而本次研究所占比例较高，与藏绵羊食用草类植物较多有一定的关系，并且需要进一步验证。综上所述，本次研究对于了解藏绵羊肠道的乳酸菌组成，并开发相应的乳酸菌制剂有一定的参考作用。

[1]王欣荣,吴建平.藏羊脑动脉系统结构特征与高原适应性研究[J].家畜生态学报,2013(08).

[2]张冰,张焕容,汤承,王永.藏系绵羊源沙门菌和产志贺毒素大肠埃希菌的分离与PCR鉴定[J].动物医学进展,2013(04).

[3]张雪峰,杨应忠,裴志伟.藏羚羊和藏系绵羊血液内分泌激素水平的比较研究[J].生理学报,2011(04).