一株产红色素真菌的鉴定及色素稳定性分析

张立强等

摘要：分离得到一株可产生红色素的真菌，序列分析显示该真菌的18S rDNA与黑曲霉菌（Aspergillus niger）的重叠群序列An03c0110、An03c0100的一致性达到100%，因此将此真菌初步鉴定为黑曲霉菌。通过分析红色素特征吸光度的变化，研究了温度、pH变化对色素稳定的影响，结果显示该色素在温度10～100 ℃，pH 5～9条件下保持稳定。

关键词：黑曲霉菌（Aspergillus niger）；红色素；稳定性；18S rDNA

中图分类号：S948 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-2863-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.013

Characterization of a Red Pigments Producing Fungus and Study

on the Stabilty of the Red Pigments

ZHANG Li-qiang1，LIANG Hua-bing2，AI Tao-shan1，YU Yun-zhen1，DING Gui-zhen1，ZHANG Guang-hua1

（1. Wuhan Fishery Science Research Institute， Wuhan 430207， China；

2. College of Life Science， South-Central University for Nationlities， Wuhan 430074， China）

Abstract： A strain of red pigments producing fungus was isolated in this research. 18S rDNA sequence analysis revealed homology 100% identities with Aspergillus niger contig An03c0110 and Aspergillus niger contig An03c0100， so this fungus was identifyed as an Aspergillus niger strain. The stability of this red pigments under different temprature and pH were studied by analyzing its specific abosorbance. The red pigments were stable under the condition of 10～100 ℃ and pH 5.0～9.0.

Key words： Aspergillus niger；red pigments；stability；18S rDNA.

天然红色素大多来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实、动物和微生物等的天然色素，生产量低，来源复杂，获取麻烦，天然色素色泽不稳定，在其使用过程中容易受各种因素的影响而发生褪色、变色等方面的变化，而影响其着色效果，严重制约了天然色素代替人工合成色素的进程[1，2]。人们很早就知道真菌能产生颜色各异的色素，但主要作为分类鉴定指标，并未认识到真菌色素的应用价值。真菌色素种类繁多，利用真菌生产天然色素有很多优势，例如生长快、易培养、易于进行大规模工业化生产等。因此，应用现代发酵技术生产真菌色素不仅可以克服生产天然植物色素和动物色素的缺点，还可以节约宝贵的自然资源，降低生产成本[3]。因此，利用微生物资源，尤其是真菌资源越来越受色素生产厂商的青睐。

目前对真菌色素的研究相对较少，特别是产红色素真菌的报道仅集中在产紫青霉（Penicillium purpurogenum）[4]、草酸青霉（Penicillium oxalicum）[5]、红曲霉（Monascus purpureus Went.）[6]、拟分枝孢镰刀菌（Fusarium sporotrichioides）[7]、偏侧蛇虫草菌（Ophiocordyceps unilateralis）[8]等几种真菌上，在黑曲霉菌（Aspergillus niger）中尚未发现产红色素的报道。本研究分离得到一株可产红色素的真菌，为了更好地获得红色素，本研究对培养基进行了优化。色素的稳定性是色素应用中的重要问题，色素稳定性的好坏将直接影响到着色物质的色泽和品质，本研究测定了红色素的特征吸光度，并进一步研究了温度和pH变化对吸光度的影响，以此评价红色素的稳定性，为色素的开发利用奠定了基础。为了确定该真菌的种属，本研究通过18S rDNA序列对其进行了分子鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究菌株源自玫瑰愈伤组织培养时可使培养基变红的一株丝状污染真菌。CTAB、蛋白酶K；Tris、EDTA、β-巯基乙醇购于华美生物工程公司；DL2000、T载体，PCR体系、目的片段回收试剂盒均购自TaKaRa公司；琼脂糖购自Bio-west公司；马铃薯为市售；其他试剂为国产分析纯。

1.2 菌株产红色素培养基优化

分别采用MS培养基；2倍有机物MS培养基； 3倍有机物MS培养基，pH 7.0，于28 ℃条件下培养并观察记录结果。

1.3 红色素稳定性分析

1.3.1 红色素溶液的分离及除糖 将固体培养基倒出，去除表面菌体，将培养基转至烧杯中搅碎，抽滤得到红色液体，将此红色溶液离心取上清，用0.45 μm滤膜过滤，装入旋转蒸发仪内40 ℃条件下浓缩，取3支50 mL离心管，分别加入5 mL浓缩液和45 mL无水乙醇，产生浅红色絮状物，振荡后放入离心机4 000 r/min条件下离心4 min，取上清液再次旋蒸，得到除糖浓缩液，溶液于4 ℃冰箱保存。

1.3.2 红色素的最大吸光度检测 取上述已经处理过的红色素，以水作为对照组，利用紫外分析仪在波长为400～550 nm间进行吸光度测定，并记录。

1.3.3 红色素的耐温测试 取红色素溶液3 mL，稀释10倍后分装于10个5 mL的试管中，每管3 mL，标记号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。分别放置于10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 ℃水浴条件下处理30 min，观察并记录溶液颜色及吸光度[9]。

1.3.4 红色素耐酸碱测试 取上述处理过的红色素分别在pH 2、pH 3、pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10、pH 11条件下测定其吸光度并观察其颜色的变化[10]。

1.4 真菌DNA的提取

采用CTAB法提取该真菌的基因组[11]。

1.5 真菌分子鉴定

引物合成及扩增：引物为18S rDNA通用引物：NS1：5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′，NS8：5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用PTC-100型扩增仪（美国MJ公司）进行序列扩增。20 μL的PCR反应体系包括DNA模板2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，上下游引物各0.5 μL和 Taq DNA聚合酶0.2 μL，ddH2O 14 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶中检测产物的特异性。

运用PCR产物回收试剂盒（南京金斯瑞生物科技有限公司）纯化回收目的DNA片段，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，利用Blast程序进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 菌株生理性质的研究结果

2.1.1 菌株不同培养基培养试验结果 由表1可知，菌体生长到一定阶段产生红色素，且颜色逐渐加深至红色。同时，研究表明，提高MS培养基中的有机物含量至2倍时可以获得最佳的红色素产生效果，即在MS（有机物扩大2倍）培养基的条件下培养5 d可获得最佳红色素产生效果。更高的有机物的浓度可为真菌的生长提供更好的营养需求，但有机物浓度上升的同时带来了渗透压的问题，本研究表明，将MS培养基的有机物浓度提高至两倍最适合菌体生长。

2.2 红色素的性质研究

2.2.1 红色素的最大吸光度检测 红色素的测定结果见图1，其最大紫外吸光度为0.29，该处波长为500 nm。

2.2.2 红色素的耐温测试 红色素随着温度的升高其吸光度无明显差别，同时颜色也基本无变化（图2），这表明试验所得红色素为一种热稳定的物质。

2.2.3 红色素液体pH稳定性 红色素溶液pH 5～9时，随着pH的增大红色素吸光度在0.29上下波动，变化不明显。随着pH的下降，吸光度也随之下降，当pH 3时降到最低（图3），总体来看，试验所得红色素对pH变化不敏感。

2.3 真菌18S rDNA序列分析

PCR扩增得到一条特异性的18S rDNA片段（图4），此序列经过T-A克隆、测序最终确定其长度为1 770 bp，Blast比对结果显示该序列与黑曲霉菌序列An03c0110和An03c0100的18S rDNA序列的Query coverage为100%，E value为0，Max ident为100%，因此可以确定该真菌是一种黑曲霉菌，或是它们的一个变种。

3 讨论

真菌作为一种重要的色素产生菌在其他研究中早有报道，如链霉菌、三孢布拉霉菌、产紫青霉等[3，4]，本研究发现的这株产红色素的菌类是对产色素菌的进一步丰富。18S rDNA测序结果显示该霉菌属于黑曲霉菌，其最适产红色素的培养基为有机物浓度提高了2倍有机物MS培养基，这提示该红色素很可能是一种次级代谢产物，该物质产量随着有机物浓度的提高而上升，但是更高的有机物浓度也带来了更高的渗透压，导致在3倍有机物MS培养基中色素产量反而不及在2倍有机物MS培养基中色素的产量。红色素稳定性研究表明，该色素具有耐温性质，在100 ℃条件下均未表现出明显的性质变化，耐酸碱试验发现，该物质在pH 5～9时均表现较稳定，这可能与该色素为一种小分子代谢产物有关。接下来的研究将进一步确定红色素的成分，为天然红色素的开发利用提供理论基础。

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