不同产地苕叶细辛中马兜铃酸A的HPLC测定

高智席等

摘要：建立了反相高效液相色谱法测定苕叶细辛（Asarum Insigne Diels）中马兜铃酸A含量的方法。色谱柱为Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰乙酸=70∶30（V/V）为流动相，检测波长为225 nm。结果表明，马兜铃酸A在0.087 4～8.098 0 μg/mL（R2=0.999 7）范围内与峰面积呈良好线性关系，平均回收率为96.95%～99.42%，相对标准偏差为2.63%～3.72%，检测限为0.003 μg/mL。该方法灵敏度高、操作简便、结果准确、重复性好，可用于苕叶细辛中马兜铃酸A的测定。

关键词：苕叶细辛（Asarum Insigne Diels）；马兜铃酸A；反相高效液相色谱法

中图分类号：O657.7+2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-3008-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.054

Determination of Aristolochic acid A in Asarum Insigne Diels

from Different Places by HPLC

GAO Zhi-xi1，2， LI Si1， JIANG Zhong-yuan1， HU Hai-jun2， HAN Chang2， L？譈 Chao-yan2

（1. Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei， Zunyi 563002， Guizhou， China；

2.institute of Agricultural science and Technology， Zunyi Normal College，Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract： Aristolochic acid A in Asarum insigne Diels was determined by reversed-phase high performance liquid chromatography （HPLC）. The analysis was performed with Shim-pack VP-ODS column（150 mm × 4.6 mm，5 μm） with the mobile phase of MeOH∶0.1%acetic acid=70∶30（V/V） at 225 nm. The results showed that the Aristolo chicacid A had a good linear relationship in the range of 0.087 4～8.098 0 μg/mL（R2=0.999 7）. The average recoveries were 96.95%～99.42% with RSD of 2.63%～3.72%， and the detection limit was 0.003 μg/mL. This method is sensitive， convenient， accurate and reproducible for determining aristolochic acid A in Asarum insigne Diels.

Key words： Asarum insigne Diels； aristolochic acid A； RP-HPLC

苕叶细辛（Asarum insigne Diels）为马兜铃科细辛属植物，常作中草药使用，以全草入药，具有祛风散寒、止咳祛痰、活血解毒、止痛之功效，临床上用于治疗风寒感冒、风湿性关节疼痛、咳嗽、跌打损伤等。马兜铃酸A为硝基菲酸类化合物，可作用肾小管上皮细胞、肾间质成纤维细胞，降低肾小球滤过率，使血、尿肌酐增加，引起肾衰竭，急性马兜铃酸肾病、肾小管功能障碍型马兜铃酸肾病、慢性马兜铃酸肾病及癌症等[1，2]。因此分析苕叶细辛中的马兜铃酸A对指导苕叶细辛的用药量具有重要意义。目前分析马兜铃酸A的方法包括高效液相色谱法[3，4]、薄层色谱法[5]。本试验建立了反相高效液相色谱法测定马兜铃酸A含量方法，其灵敏度高，分离效果好，为细辛属植物中马兜铃酸A的含量分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

马兜铃酸A标准品（110746-200507）购于中国药品生物制品检定所，分析纯甲醇购于成都市科龙化工试剂厂，去离子水。所有溶液使用前均由0.45 μm孔径的滤膜过滤。市售5批苕叶细辛样品由遵义医学院黎刚老师鉴定，0～5 ℃保藏待用。

1.2 仪器

2010AT型高效液相色谱仪，LC solution工作站，CBM-20A控制器，SPD-M20A二极管阵列检测器，SIL-20A自动进样器（日本岛津公司生产），SY3200超声波清洗器（上海声源超声波仪器设备有限公司生产），电子天平（上海越平科学仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱Shim-pack VP-ODS（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相甲醇：0.1%冰乙酸水溶液（70∶30，V/V）；紫外检测波长225 nm；流速0.6 mL/min；进样量20 μL。

1.3.2 标准溶液的配制 称取干燥至恒重的马兜铃酸A对照品13.6 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇25 mL，超声处理25 min，溶解放冷，加甲醇至刻度，摇匀，即为544 μg/mL马兜铃酸A储备液，冷藏备用。取配好的标准溶液1.0 mL于25 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，同法按该比例稀释获得梯度溶液，冷藏备用。

1.3.3 样品前处理 称取干燥的苕叶细辛药材粉末约1 g于25 mL容量瓶中，加入含10%（V/V）甲酸的丙酮溶液20 mL，浸泡7 d，超声提取45 min，放冷，定容至刻度，摇匀，经微孔滤膜（0.45 μm）过滤，冷藏待测。

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

通过二极管阵列检测器在线扫描马兜铃酸A标准溶液，其紫外-可见吸收光谱见图1，其3个吸收峰的最大吸收波长分别为206、225和250 nm。考虑溶剂基体干扰、灵敏度、分离度等因素，选定225 nm为检测波长。该条件下，对样品测定无影响，且色谱峰形较好。

2.2 流速的选择

以甲醇和0.1%冰乙酸（V/V=70∶30）为试剂空白，测定不同流速（0.5～1.2 mL/min）对标准品保留时间的影响，结果表明当流速为0.6 mL/min时，马兜铃酸A的出峰时间较早，分离效果较好，故选择流速为0.6 mL/min。

2.3 流动相的选择

分析不同体积比例的甲醇与0.1%冰乙酸流动相，由50∶50（V/V）增至95∶5（V/V），结果表明，马兜铃酸A的保留时间随甲醇比例升高而减少，峰面积也逐渐增大，故选择甲醇∶0.1%冰乙酸水溶液为70∶30 （V/V）作为流动相。

2.4 线性范围及检出限

将系列梯度浓度的标准液进样分析，绘制峰面积A对浓度C的标准曲线，得线性方程为Y=178 503X+51 470，R2=0.999 7，线性范围为0.087 4～8.098 0 μg/mL；马兜铃酸A保留时间为15 min（图2和图3）。按上述色谱条件测定5 次，求出其标准偏差，方法检出限为0.003 μg/mL。

2.5 方法评价

取同一批苕叶细辛药材粉末6份，平行测定马兜铃酸A的含量，其RSD为2.26%，表明方法重复性良好；取样品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h测定马兜铃酸A，其峰面积RSD为1.78%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

在贵州苕叶细辛样品分别添加0.01、0.05、0.10 mg/kg 3个水平的马兜铃酸A，经上述方法分析，计算回收率在96.95%～99.42%之间，RSD（n=3）为2.63%～3.72%，该法灵敏度、精密度、重复性以及回收率符合相关标准要求，适用于苕叶细辛样品中马兜铃酸A的测定。

2.6 样品测定

测定不同产地苕叶细辛样品中的马兜铃酸A含量，结果见表1。

3 小结

本试验建立了苕叶细辛中马兜铃酸A的RP-HPLC的测定方法。结果表明，来源于贵州、广西、广东和新疆的苕叶细辛中的马兜铃酸A含量均高于0.025 mg/g。该方法检出限低、重现性好、精密度高，并且操作简便、快速，适用于苕叶细辛样品中马兜铃酸A的测定。

参考文献：

[1] 杨 莉，庄 洁，李东梅.含马兜铃酸成分药物的安全应用[J].首都医药，2005（5）：38-40.

[2] 鲁 静.马兜铃相关中药材的探讨[J].中国药品标准，2002， 3（2）：49-51.

[3] 曹 蕊，张春红，王 铮，等.RP-HPLC法测定不同方法炮制关木通中马兜铃酸的含量[J].现代农业科技，2009（10）：14-15，17.

[4] 韩 娜，路金才，毕开顺，等.RP-HPLC法测定14种中药材中马兜铃酸A的含量[J].沈阳药科大学学报，2008，25（2）：115-118.

[5] 黄顺旺.北细辛中不含马兜铃酸的薄层色谱法鉴别[J].安徽医药，2003，7（4）：299-300.