裸花紫珠的组培快繁技术体系

朱红林，徐 靖，陈健晓，熊怀阳，王效宁

（海南省农业科学院 粮食作物研究所／农业部作物基因资源与种质创制海南科学观测试验站，海南 海口571100）

裸花紫珠（Callicarpa nudiflora）为马鞭草科紫珠属植物，是我国珍稀药材之一，主要分布于海南、广东、广西地区，生于平地至海拔1 200m的山坡、谷地、溪旁林中或灌木丛中［1］。干燥地上部分为药用，化学成分主要包括黄酮类、萜类、挥发油和酚类等，具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、驱风祛湿之功效［2］。一直以来，裸花紫珠的原材料供给主要是依靠采挖野生资源，随着市场需求量逐年增加，野生资源逐年锐减，已不能满足生产需要。由于裸花紫珠种子最佳采种时间短以及种子不宜储藏，分株繁殖苗的系数和效率较低［3－4］，无法提供大批优质种苗，以满足产业化基地生产的需要。目前，国内研究报道侧重在药理分析、治疗效果等方面［2，5］，但在组培快繁方面较少，且仍停留在试验阶段，还未应用于规模化产业生产［6－7］。因此，笔者以实现裸花紫珠快速繁殖为目的，进行外植体消毒时间、6－BA和NAA及不同基质对成苗的影响试验，建裸花紫珠组培快繁技术体系，为裸花紫珠种苗的规模化生产提供可靠的技术途径。

1 材料与方法

1.1 植物

野生裸花紫珠当年生茎段，植株采自海南五指山。

1.2 外植体消毒及接种

于晴天午后，剪取当年生茎段置流水冲洗2～3h，晾干水分，分成5份。在超净工作台上用75%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液分别振荡浸泡灭菌3min、5min、8min、10min、12min，无菌水冲洗5遍。将消毒的外植体，切成约1.5～2.0cm的单节茎段，接种到诱导培养基中。外植体接种培养20d后，统计污染率、萌芽率和不定芽长势。

1.3 诱导培养

以MS为基本培养基，分别添加6－BA 0mg／L、0.5mg／L、1.0mg／L、1.5mg／L、2.0mg／L 5个浓度水平，每瓶接种4个外植体，每处理接种10瓶。接种30d后统计茎段芽诱导率，其间观察诱导出芽的生长状况。

1.4 继代增殖培养

当诱导出的芽长4cm左右时，将其切割成单节茎段，接种到以MS为基本培养基、分别添加不同浓度 6－BA （0.5mg／L，1.0mg／L，1.5mg／L，2.0mg／L）和 NAA （0mg／L，0.05mg／L，0.1mg／L，0.2mg／L）的培养基中，共16个处理，每个处理5瓶，每瓶5个单节茎段，培养30d后记录生长情况，并统计诱导产生丛生芽数，计算繁殖系数。

1.5 生根培养

当增殖培养过程中无根试管苗长至1.5cm左右时，从基部切下转接到生根培养基上。以1／2MS为基本培养基，添加IBA（0mg／L，0.5mg／L，1.0mg／L，1.5mg／L，2.0mg／L）5个浓度水平，共5个处理，每个处理10瓶，每瓶5株。观察记录开始生根天数及根生长情况，30d后统计生根率。

1.6 炼苗与移栽

当苗高4～6cm、生根4条以上时移入拱棚炼苗7～10d，洗净根部培养基后，放入0.2%高锰酸钾浸泡1～2min，取出晾干后，栽入基质①红土、②河沙＋红土（河沙∶红土＝1∶1）、③河沙＋椰糠＋红土（河沙∶椰糠∶红土＝2∶1∶1）、④河沙＋椰糠＋红土（河沙∶椰糠∶红土＝1∶1∶1），栽后浇透定根水，盖遮阳网，20d后揭去遮阳网，30d后随机抽查100株统计移栽成活率，计算公式：

移栽成活率＝（成活苗数／统计苗数）×100%

1.7 培养条件

诱导培养和增殖培养基中添加白砂糖30g／L，生根培养基中加白砂糖20g／L，卡拉胶均为6.0g／L，培养基pH 5.8。培养温度（28±1）℃，光照10h／d，光照强度为2 000Lx。

1.8 数据处理

用Excel 2007数据分析库进行数据统计、方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 消毒时间的确定

从表1看出，随着消毒时间的延长，外植体的污染率下降，在3～10min，萌芽率随消毒时间的增加而增加，高达70%，且不定芽长势较壮（图示A），而当消毒时间增加到12min时萌芽率下降，不定芽长势弱，说明消毒时间长，消毒效果好，但时间过长，消毒剂对外植体也会产生伤害。综合考虑污染率和萌芽率，裸花紫珠当年生茎段最佳的升汞消毒时间为10min。

2.2 6－BA对芽诱导的影响

接种培养10d后，外植体在诱导培养基上直接从茎节处分化出芽点。6－BA对裸花紫珠茎段芽诱导影响很大，当培养基中未加6－BA时，芽诱导率仅12.5%；而当6－BA浓度为0.5mg／L时，萌发率最高，达87.5%；随6－BA浓度的升高，芽诱导率反而下降，且叶片玻璃化；当6－BA浓度高达2.0mg／L时，只有愈伤组织，不分化芽（表2）。

2.3 激素组合对芽增殖的影响

表1 不同消毒时间裸花紫珠的外植体Table 1 Explants of C.nudifloratreated with different sterilization time

表2 不同6－BA浓度裸花紫珠的芽诱导与生长状况Table 2 Bud induction of C.nudifloratreated with different 6－BA concentration

从表3看出，单节茎段（图示B、C）在16种激素组合处理中的增殖系数差异很大，最高的达12.7，最低的只有3.2。6－BA浓度为0.5mg／L时，丛生芽增殖系数低，均在5.0以下，但丛生芽芽苗粗壮；6－BA浓度为2.00mg／L时，丛生芽增殖系数最高，但丛生芽芽苗细弱，大量玻璃化，而且植株节间很短，苗高1.0～1.5cm，不利于生根培养；6－BA浓度为1.50mg／L时，丛生芽增殖系数为7.62～10.62，虽然增殖系数低于6－BA浓度2.00mg／L，但丛生芽芽苗壮，平均株高1.5cm，利于生根，说明较低和较高浓度的6－BA对丛生芽的增殖效果均不理想。

表3 不同激素组合裸花紫珠单节茎段芽的增殖情况Table 3 Bud multiplication of C.nudiflora plantlets with different hormone combinations

对影响因子6－BA、NAA各处理的增殖系数进行方差分析得到，6－BA和NAA对丛生芽增殖的影响均达极显著水平，其中：6－BA对丛生芽的诱导影响作用大于NAA，6－BA和NAA的相互作用对丛生芽的增殖存在极显著影响，两者适宜的配比，丛生芽的增殖效果最好。6－BA和NAA的多重比较表明，6－BA 1.50mg／L 与0.50mg／L、1.00mg／L、3.00mg／L差 异 极 显 著，NAA 0.05mg／L 与0mg／L、0.10mg／L、0.20mg／L的差异也达极显著，6－BA 1.50mg／L与 NAA 0.10mg／L 两 者 配合，丛生芽的增殖系数最大，而且丛生芽的生长状况也较好。

2.4 IBA对生根的影响

从表4看出，在5种不同处理中，试管苗的株高无显著性差异，生根天数、根条数、根长和根诱导率均存在显著差异。未添加IBA的生根效果最差，根诱导最慢，20d后才开始生根，且根少、短，生根率仅有12.0%；低浓度的IBA，生根效果不理想，高浓度的IBA对生根也不利；只有IBA 1.0mg／L时，苗发根早、根多、粗壮，且有须根，利于炼苗移栽（图示D、E）。

2.5 基质对组培苗生长的影响

裸花紫珠组培苗在不同的移栽基质中成活率和株高均有不同（表5），基质组合①、②和③、④之间差异显著，基质组合③和④之间差异不显著，且组培苗的移栽成活率高，生长健壮（图示F）。因此，选用河沙∶椰糠∶红土＝（1～2）∶1∶1基质配方移栽裸花紫珠组培苗较好。

表4 不同IBA浓度裸花紫珠组培苗的根分化情况Table 4 Root differentiation of C.nudiflora plantlets with different IBA concentration

表5 不同移栽基质裸花紫珠组培苗的生长情况Table 5 Growth plantlets of C.nudiflora with different transplanting substrate

图示 组织培养快繁裸花紫珠的植株性状Fig. Character of C.nudiflora plantlets from rapid propagation

3 结论与讨论

本研究建立的裸花紫珠组培快繁技术体系：于晴天午后，剪取野生裸花紫珠茎段为外植体，流水冲洗后，用0.1%升汞溶液消毒10min，接种于培养基MS＋6－BA 0.5mg／L＋ 白 糖 30g／L＋ 卡 拉 胶6.0g／L（pH 5.8）中诱导，当诱导出的丛生芽长4cm左右时，将其切割成单节茎段置于培养基MS＋6－BA1.50mg／L＋NAA0.01mg／L＋30g／L白糖＋6.0g／L卡拉胶（pH 5.8）中继代增殖，当增殖长出的无根试管苗长1.5cm左右时，即从基部切下转接到生根培养基1／2MS＋IBA1.0mg／L＋白糖20g／L＋卡拉胶6.0g／L（pH 5.8）中，当苗高4～6cm、生根4条以上时炼苗、移栽于基质V河沙∶V椰糠∶V红土＝（1～2）∶1∶1中，外植体芽诱导率为87.5%，继代增殖繁殖周期为30d，增殖系数为10，生根率100%，移栽成活率超过95%。

6－BA作为外源生长调节物质具有快速、非极性运输特性，在植物体各个部位均有分布，以茎尖和根部浓度较高［8］。在培养基中加入6－BA，是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽［9］，在本研究的外植体芽诱导试验中，添加0.5mg／L 6－BA的芽诱导率是未添加的7倍，表明6－BA是裸花紫珠外植体芽诱导的关键激素。

不同植物生长调节剂配合有叠加作用，比单一生长调节剂更能促进丛生芽或不定芽的形成与增殖［10］。在本研究中，6－BA 1.50mg／L 单独使用时增殖系数为7.62，与NAA 0.10mg／L配合使增殖系数达10.62，差异达极显著水平，且丛生芽的生长状况良好。本研究与潘梅等［7］研究适用于裸花紫珠增 殖 的 激 素 组 合 6－BA 2.00mg／L＋ NAA 0.05mg／L不同，可能与外植体的取材不同、基本培养基的组分差别有关。潘梅等［7］采用的是种子接种培养无菌苗作外植体，而本研究是取用野生裸花紫珠茎段作外植体；潘梅等［7］是用蒸馏水和蔗糖配制培养基，而本研究是用自来水和市场白砂糖配制培养基，自来水的成分会影响培养基组分。

［1］ 广东植物研究所.海南植物志［M］.北京：科学出版社，1970：10.

［2］ 蔡金平，董 琳，关薇薇，等.裸花紫珠的研究进展［J］.现代药物与临床，2012，27（1）：1.

［3］ 黄秋银，蓝祖栽，潘春柳，等.裸花紫珠种子萌发影响因素研究［J］.安徽农业科学，2009，37（25）：12006－12007.

［4］ 聂 垚，吴永忠，余宝平，等.裸花紫珠种苗繁育与栽培技术［J］.现代园艺，2010（12）：23－24.

［5］ 谷陟欣，刘宇婧，颜冬兰，等.裸花紫珠、大叶紫珠和广东紫珠的研究进展［J］.中国医药导报，2011，29（8）：11－12.

［6］ 姚 宏，刘南祥，吴华芬，等.大叶紫珠的组织培养与快速繁殖［J］.植物生理学通讯，2008，44（1）：135.

［7］ 潘 梅，黄 赛，王景飞，等.药用植物裸花紫珠的组织培养与快速繁殖研究［J］.中国农学通报，2013，29（7）：127－132.

［8］ 张 平，黄卫东.6－BA在葡萄植株体内的运转和分配［J］.果树学报，2002，19（3）：153－157.

［9］ 李浚明，朱登云.植物组织培养教程［M］.北京：中国农业大学出版社，2005：31.

［10］ 曹孜义，刘国民.实用植物组织培养技术教程［M］.甘肃：甘肃科学技术出版社，2003：53.