乳酸链球菌素对速溶茶中耐热菌抑制作用研究

邵增琅，宣娟娟，王晓霞，彭月琴，闫征

（1.南京融点食品科技有限公司，江苏南京 211300；2.江苏省农业科学院，江苏南京 210014）

乳酸链球菌素对速溶茶中耐热菌抑制作用研究

邵增琅1，宣娟娟1，王晓霞1，彭月琴1，闫征2*

（1.南京融点食品科技有限公司，江苏南京 211300；2.江苏省农业科学院，江苏南京 210014）

摘要：乳酸链球菌（Nisin）是一种由34个氨基酸组成的天然抗菌素，对革兰氏阳性菌具有广谱抑菌作用。文章就Nisin对于速溶茶中耐热芽孢和TAB的抑制作用及其与超高温瞬时灭菌（UHT）的协同作用进行了研究，结果表明：随着Nisin浓度的增加，耐热芽孢和TAB的数量急剧下降，添加量达到100 mg/L时，抑菌率达到100%；添加Nisin后，耐热芽孢和TAB抗热性降低，达到完全灭菌的温度由131℃降低至121℃，UHT和Nisin之间存在显著的协同抑菌作用，添加Nisin能有效降低UHT的温度水平。

关键词：速溶茶；乳酸链球菌素；耐热芽孢；嗜热嗜酸菌；抑制作用

中国茶叶加工2015（1）：31～34，66

速溶茶粉是茶叶通过提取、浓缩、灭菌、干燥后所得的一种广泛应用于茶饮料生产的茶叶深加工产品。为了使速溶茶的风味能够更加接近茶叶原有的风味，在加工过程中所选用的工艺及参数要求尽量减少对茶叶原有风味的影响。速溶茶粉在加工和贮运过程中容易受到微生物污染，从而影响茶粉和茶饮料产品的货架期。因此，必须控制速溶茶产品的微生物水平，特别是速溶粉茶中耐热芽孢的水平［1］。通常，速溶茶因水分含量很低，其中的耐热芽孢对其货架期的影响较小；但当速溶茶粉加工成茶饮料时，处于休眠状态的耐热芽孢萌发，对茶饮料产品的食用安全性造成严重的威胁。在目前的速溶茶生产工艺中，对微生物的控制除了生产过程的清洗消毒外，最主要的方式是通过超高温灭菌进行。超高温灭菌温度对于速溶茶风味有着非常大的影响，相同灭菌时间下温度的提高将大幅降低速溶茶的品质，尤其影响速溶茶风味［2］。

乳酸链球菌素（Nisin），是从乳酸链球菌的发酵产物中提取的一种无毒副作用，热稳定的小分子多肽［3］。经研究表明，Nisin食用后在消化道内很快被胰凝蛋白酶水解为氨基酸，不影响肠道内的正常菌群，是唯一一种可作为防腐剂应用于食品的细菌素，有很高的安全性［4］。Nisin对大多数革兰氏阳性菌有明显的抑制作用，特别是对于耐热芽孢杆菌的抑菌活性比营养体更为有效［5-7］。Nisin作为一种高效、无毒、安全、无副作用、耐酸耐热的天然食品防腐剂，世界上不少国家如英、法、澳大利亚等对Nisin的添加量都不作任何限制；1990年，我国批准其可用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品以及肉制品中，在《食品添加剂使用标准》中Nisin的应用范围已经增加到包含饮料类的15大类［8］。

大量研究表明添加 Nisin进行热处理时，Nisin与热处理产生协同杀菌作用，可以明显增强杀菌效果，降低热处理所需的温度和时间，获得较长的货架期，更好地保留食品原有的营养成分及风味［5，9-12］；食品工业饮料加工中采用高温灭菌是必不可少的一个工序，而在饮料加工中添加Nisin不仅能抑制耐酸、耐热细菌（如酸土芽孢杆菌）的生长和繁殖，防止饮料的酸败，还能延长产品的保质期。目前，Nisin已应用于果汁饮料、醋酸饮料、芦荟饮料、含乳饮料、保健饮料等的加工中［13］。添加Nisin既可以降低灭菌温度，又可以延长产品的货架期，这样具有这样双重作用的食品防腐剂并不多见。降低灭菌温度对食品工业饮料加工意义重大［13］。

本文拟用速溶茶粉为材料，研究分析Nisin对速溶茶粉中耐热芽孢及嗜热嗜酸菌（TAB）的抑制效果，以及其对速溶茶加工过程中超高温瞬时热处理（UHT）的辅助作用，以期达到提高杀菌效率，降低热灭菌温度，减少灭菌中速溶茶风味损失，提高速溶茶品质的目的，为进一步提升速溶茶加工工艺探索新的路径。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

速溶茶浓缩液由南京融点食品科技有限公司提供；Nisin（乳酸链球菌素）购自安泰生物工程股份有限公司，效价≥900 IU/mg；平板计数琼脂培养基（PCA）、琼脂粉、YSG培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2仪器与设备

ZLP-12小型喷雾干燥塔（无锡禾明干燥有限公司）；PT-20TS超高温瞬时热处理设备 （上海沃迪自动化装备股份有限公司）；GNP-9160 BS-Ⅲ隔水式恒温培养箱 （上海新苗医疗器械有限公司）；LRH-250生化培养箱 （上海齐欣科学仪器厂）；LDZM-80KCS高压灭菌锅 （上海申安医疗器械厂）；DRA-3全速过滤设备（包括滤杯、抽滤瓶、滤床、真空泵、不锈钢镊子以及无菌滤膜）（天津市东康科技有限公司）。

1.3方法

1.3.1耐热芽孢及TAB培养

耐热芽孢培养：采用常规PCA营养琼脂培养方法［14-15］并加以改进。将100 g碎茶叶用1000 mL，35℃水浸提2 h，用中速滤纸抽滤过滤，将滤液定容到1 L，取500 mL滤液经85℃，25 min加热处理后，无菌条件下用0.45 μm微孔滤膜抽滤后，将抽滤后的滤膜用无菌镊子从过滤器上移取滤膜贴于PCA培养基上，轻轻按压滤膜，保证与培养基接触。倒置于36±1℃恒温培养5 d，获得耐热芽孢菌落。

TAB培养：参考钟旭美设计的实验方法并有所调整［16］，取500 mL上述滤液经70℃，20 min加热处理后，在无菌条件下用0.45 μm微孔滤膜趁热抽滤后，将抽滤后的滤膜用无菌镊子从过滤器上移取滤膜贴于YSG培养基上，轻轻按压滤膜，保证与培养基接触。倒置于30℃恒温培养5 d，获得TAB菌落。

1.3.2带菌速溶茶粉的制备

取将1.3.1培养所得的耐热芽孢及TAB菌落稀释到无菌200 mL去离子水中，搅拌均匀，制成带菌水，再分别取三份经121℃、30 min杀菌处理浓度为20 Brix的速溶红茶浓缩液各10 kg，在浓缩液加入50 mL制备好的带菌水，搅拌均匀后分别于36℃培养1 h、6 h、24 h后，在进风温度160℃、出风温度75℃条件下喷雾干燥，制成带菌速溶茶粉样品1、样品2、样品3。

1.3.3 Nisin溶液的准备

准确称取1 g Nisin定容于 100 mL无菌水中，配置成10g/L的Nisin溶液；再吸取10mL上述溶液定容到100mL，配置成1g/L浓度的Nisin溶液。

1.3.4耐热芽孢、TAB检测方法

耐热芽孢检测：采用传统平板计数法［17-18］并做改进。取浓缩液样品10 mL加入90 mL无菌生理盐水，经85℃加热处理25 min后，过滤并贴膜，步骤与耐热芽孢培养步骤相同。培养基倒置于36±1℃培养48±2 h。培养结束后PCA膜片上的菌落数即为耐热芽孢的数量，以CFU/g表示。

TAB检测：参考钟旭美设计的实验方法并有所调整［16］。取浓缩液样品10 mL加入90 mL无菌生理盐水，经70℃，加热处理20 min后，过滤并贴膜，步骤与耐热芽孢培养步骤相同。培养基倒置于30℃培养5 d。培养结束后YSG膜片上的菌落数即为TAB的数量，以CFU/g表示。

1.3.5不同浓度 的Nisin对速溶茶粉中耐热芽孢及TAB数量的影响

将100 g带菌速溶茶粉样品1加入无菌水定容到1000 mL，配置成100 g/L的浓缩液作为试验样。分别取试验样99 mL，对照样加入1 mL无菌水，试验样分别加入1 mL配置好的1 g/L Nisin溶液、无菌水0.5 mL和10 g/L Nisin溶液0.5 mL、10 g/L Nisin溶液1 mL，使样品中的Nisin浓度分别为0、10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L，检测耐热芽孢及TAB数量。试验重复2次，以下同。抑制率按以下公式计算：

抑制率（%）=（对照组菌落数-实验组菌落数）×100/对照组菌落数

1.3.6 Nisin对不同带菌速溶茶粉中耐热芽孢及TAB数量的影响

分别将100 g带菌速溶茶粉样品1、2、3加入无菌水定容到1 L，配置成100 g/L的浓缩液，分别取试验样99 mL，加入1 mL 10 g/L Nisin溶液，使浓缩液中的Nisin浓度达到100 mg/L，检测耐热芽孢及TAB数量。

1.3.7 Nisin对速溶茶浓缩液UHT杀菌效果的影响

将500 g带菌速溶茶粉样品1加入无菌水定容到5 L，配置成100 g/L的浓缩液，在浓缩液中加入不同体积1 g/L Nisin溶液，使试验样中的Nisin浓度分别为0、5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L，将试验样分别经超高温瞬时处理（UHT），设置温度为111℃、116℃、121℃、126℃、131℃下处理4 s，检测耐热芽孢数量和TAB数量。每个处理设2次重复。

1.4数据处理与统计

采用Excel、SAS软件进行试验数据统计与处理，通过ANOVA方式，采用Duncan's multiple range tests对不同处理之间的差异性在P＜0.05水平上进行分析。

2　结果与分析

2.1 不同浓度的 Nisin对耐热芽孢及TAB数量的影响

从表1可以看出，不同浓度的Nisin对于速溶茶粉中相对数量较少的耐热芽孢和产芽孢的TAB有明显的抑制作用，浓度为10 mg/L时就能取得明显的抑制效果，且抑制作用与浓度成正相关，随着Nisin浓度的增高，抑制作用越明显；Nisin浓度达到100 mg/L时能完全抑制样品中的耐热芽孢及TAB，且对于TAB的抑制效果更强，这可能与TAB的原始带菌数量相对较低有一定的关系。

2.2 Nisin对不同带菌速溶茶粉中耐热芽孢及TAB数量的影响

表1　Nisin浓度对耐热芽孢和TAB数量的影响Table 1 Effect of different concentrations of Nisin on number of heat-resistant spores and TAB

表2列出了样品1～3的原始耐热芽孢和TAB数量。由表3可以看出，Nisin对耐热芽孢的抑制作用随样本中原始耐热芽孢含量的提高而下降，抑制率从100%下降到了66.1%。对TAB的抑制率也随着菌密度的上升而显著下降（P＜0.05）。由此可见原始耐热芽孢和TAB数量是影响Nisin使用效果和使用量的重要因素。

表2　样品中原始耐热芽孢和TAB数量Table 2 Samples of the original number of heat-resistant spores and TAB

表3　原始耐热芽孢和TAB数量对Nisin抑菌效果的影响Table 3 The number of original heat-resistant spores and TAB on the effect of Nisin antibacterial

2.3 Nisin对速溶茶浓缩液UHT杀菌效果的影响

由图1、图2可以看出，UHT灭菌温度与耐热芽孢和TAB的灭杀率正相关，当灭菌温度为131℃时可完全杀灭耐热芽孢和TAB；当添加Nisin时达到相同灭杀效果的灭菌温度明显下降 （P＜0.05），且与添加量呈正相关。当Nisin添加量为15 mg/L时，茶浓缩液中的耐热芽孢和TAB的完全灭杀温度降为121℃，可见在相同灭菌温度下，添加Nisin可以大大提高对耐热芽孢和TAB的杀灭率，有效的降低热处理温度，Nisin与UHT灭菌具有显著协同抑菌作用。

图1　UHT灭菌温度对耐热芽孢杀灭率的影响Fig.1 UHT sterilization temperature on the effect of the killing rate of heat-resistant spores

图2　UHT灭菌温度对TAB杀灭率的影响Fig.2　UHT sterilization temperature on the effect of the killing rate of TAB

3　讨论

Nisin的抑菌机理类似于阳离子表面活性剂，影响细菌胞膜和抑制革兰氏阳性菌的胞壁质合成，对孢子的作用是杀死孢子，即在预突出体膨大阶段对芽孢产生抑制作用［13］。Nisin与UHT杀菌相结合，一方面可大大提高腐败菌对热的敏感性，尤其是芽孢［19］；另一方面，当杀菌过程完成后，混合物中的Nisin仍保持一定的活力，经121℃热处理3 min后存活下来的孢子比未经加热损伤的孢子对Nisin敏感10倍以上，因此这些残留的Nisin也能抑制芽孢的发芽［20］。在UHT灭菌前添加适量的Nisin，不仅可以降低热加工强度，提高Nisin残留量，而且可以阻止存活杂菌的生长，从而防止产品的腐败，这也是Nisin适用于热加工食品防腐保鲜的重要原因。

速溶茶加工中灭菌基本采用高温方式，高温导致茶水中所含的挥发性成分发生氧化或裂变反应，因此风味损失严重。即使添加香精，同样失去茶原有的天然和清新的风味，严重影响速溶茶的品质［21］。本研究结果表明在速溶茶浓缩液中添加

Nisin辅助UHT灭菌技术，可在较低温度下便达到灭菌效果，减少对原茶叶风味的破坏，提高产品品质，为生产优质速溶茶提供了一个新的方法。

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中图分类号：Q949.3；TS272.5+9

文献标识码：A

文章编号：2095-0306（2015）01-0031-05

收稿日期：2014-07-24

作者简介：邵增琅（1980-），男，浙江江山人，主要从事食品科学与工程方面的工作。

*通讯作者：yz3737@sina.com

Study on Controlling the Thermophilic Bacilli in Instant Tea by Nisin

SHAO Zeng-lang1，XUAN Juan-juan1，WANG Xiao-xia1，PENG Yue-qin1，YAN Zheng2*
（1.Nanjing Apogee Food Technology CO.，Ltd.，Nanjing 211300，China；
2.Jangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China）

Abstract:Nisin，a natural antibiotic composed of 34 amino acids，is primarily against a wide range of gram positive bacterium species.The paper investigated the inhibitory effect of Nisin on the heat-resistant spores and TAB，as well as synergistic antimicrobial effect between Nisin and ultra high temperature sterilization（UHT）.The results showed that：with the increase of Nisin concentration，there was a sharp decline in quantity of heat-resistant spores and TAB.When the concentration of Nisin reached 100 mg/L，the inhibition rate was up to 100%.After adding Nisin，the heat resistance of heat-resistant spores and TAB was reduced and sterilization temperature reduced from 131℃to 121℃.There were significant synergistic antimicrobial effects between UHT and Nisin，and adding Nisin could effectively reduce the sterilization temperature of UHT.

Key words:Instant tea；Nisin；Heat-resistant spores；Thermophilic acidophilic bacteria；Inhibitory effect