DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量

彦繁鹤，周金梅，吴如春

（广西民族大学化学与化工学院，广西南宁530008）

DNS法测定甘蔗渣中还原糖含量

彦繁鹤，周金梅，吴如春*

（广西民族大学化学与化工学院，广西南宁530008）

采用DNS法测定甲酸预处理甘蔗渣过程中还原糖含量，对影响DNS法的因素进行了比较研究，确定了最佳的检测条件：检测波长494 nm，显色剂用量1.5 mL，显色时间5 min，在优化的检测条件下DNS法能获得良好的检测结果。

蔗渣；DNS；还原糖；测定

甘蔗渣是制糖工业的副产品，每生产1 t的蔗糖会产生约1 t的甘蔗渣。甘蔗渣主要由纤维素、半纤维素木质素等组成[1-3]。甘蔗渣在利用过程中必须去除木质素，在采用甲酸预处理甘蔗渣过程纤维素和半纤维素会产生部分降解生成还原糖，还原糖含量的多少与纤维素、半纤维素的降解程度密切相关，也就关系到纤维素、半纤维素的可利用率，因此还原糖的测定对甘蔗渣的综合利用研究具有十分重要的意义。还原糖含量测定有多种方法，如旋光法、气相色谱法、液相色谱法、分光光度法等[4]。其中旋光法测定准确性较差，气相色谱法和液相色谱法成本高，测量过程比较复杂；相对而言，3，5-二硝基水杨酸法（DNS）[5]具有准确性较高，重现性较好，适合大批量样品的测定等特点而被广泛使用；在还原糖含量测定中，鲜有见到有用DNS法测定甘蔗渣中的还原糖，而DNS法过程中的诸多因素如吸收光谱、显色剂用量、显色剂时间[6-7]等均对测定结果的准确性有直接影响，为了能准确测定甘蔗渣中还原糖的含量，我们对用DNS法测定甘蔗渣中还原糖的含量的反应条件进行了一系列的实验，试图摸索出最佳的检测条件以保证实验结果的精准度，以期建立一准确、可靠的的分析方法为甘蔗渣的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

甘蔗渣来自广西崇左糖厂，经烘至恒重，粉碎备用。

1.1.1 样品还原糖的制备

称取一定量甘蔗渣置于三口烧瓶中，按一定比例加入甲酸水溶液后将烧瓶置于电热套中，加热至沸点反应一定时间后停止加热，过滤获取黑液。黑液经过蒸馏，加水抽滤等方法去除木质素后所得液体部分即为含一定还原糖的待测样品。

1.1.2 主要仪器

AR1140电子天平：美国奥豪斯；ZNCL-T电热套：巩义市科瑞仪器有限公司；RE52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；TU-1810PC紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；101-S型鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械厂；KQ 3200DB型数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

1.1.3 测定所需试剂

3，5-二硝基水杨酸法（DNS），1 mg/mL葡萄糖标准液。

1.2 实验方法

1.2.1 测定原理

DNS法即3，5-二硝基水杨酸比色法的英文简称，其检测原理是根据3，5-二硝基水杨酸在中性或偏碱性条件下与多糖水解的还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物—3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈正比，通过分光光度计测定溶液的吸光度值可以定量测定还原糖的含量。

图1 DNS法检测原理Fig.1 DNS method detection principle

1.2.2 DNS法测定条件的研究

1.2.2.1 DNS法测定测定波长的确定

（空两格）分别取葡萄糖标准液（1 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL试管中，取1、3、5、7号4个试管（1号为空白样），分别准确加入DNS试剂1.5 mL，用蒸馏水补至2 mL，于沸水浴中加热5 min后流水冷却，定容，超声3 min，在确定波长下测定溶液的吸光度于波长段190 nm～900 nm处进行扫描，结果空白样品和对照品在均在494 nm有最大吸收，故确定494 nm为检测时所用波长。

1.2.2.2 显色时间的确定

取葡萄糖标准液0.5 mL及蒸馏水1.5 mL于系列25 mL试管中，分别加入1.5 mL DNS试剂，置沸水浴中加热、反应不同时间后取出，流水冷却，定容，超声3 min，测定不同时间的吸光度。相同条件下测定空白溶液。

1.2.2.3 DNS试剂用量的确定

在准确加入0.5 mL葡萄糖标准溶液的系列试管中，分别加不同量的DNS试剂，沸水浴加热5 min，流水冷却，定容，超声3 min，相同条件下测定空白溶液。1.2.3葡萄糖标准曲线的制作

分别取葡萄糖标准液（1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL试管中，分别准确加入DNS试剂1.5 mL，用蒸馏水补至2 mL，沸水浴加热5 min，流水冷却，定容，超声3min，在1.4.2.1确定波长下测定吸光度。

1.2.4 样品测定

样品按照1.1.1确定的条件处理后，测定吸光度，在葡萄糖标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数。按下式1计算样品中还原糖的百分含量。

1.2.5 回收率实验

5份样品待测液中各取0.1 mL置于5个25 mL试管中，再按顺序加入1 mg/mL葡萄糖标准液0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mL，混匀，定容至25 mL，测定吸光度，计算回收率。

1.2.6 精密度试验

同时取5份样品待测液各0.1 mL测定吸光度，并计算标准偏差RSD。

2 结果与分析

2.1 显色时间对测定结果的影响

显色时间对测定结果的影响见图2。

图2 显色时间对测定结果的影响Fig.2 The influence of chromogenic time on thedetermination results

由图2可以看出，随着沸水浴加热时间的延长，吸光度变大，但在3 min～11 min内，吸光度都较稳定。故水浴加热时间在5 min即可。这一结论与孙伟伟等[8]结果一致。

2.2 DNS试剂用量及放置时间的确定

DNS试剂用量与待测液中还原糖的含量密切相关。DNS试剂用量及放置时间的确定见图3。

图3 试剂用量及放置时间对吸光度的影响Fig.3 Reagent dosage and time on the influence of the absorbance

由图3可见，随着DNS试剂用量的增加，溶液的吸光度随之增加，但DNS试剂用量增加至1.5 mL后，其吸光度数值基本上与放置时间无关。因此，选择DNS试剂的最佳用量为1.5 mL。

2.3 标准曲线

葡萄糖的标准曲线见图4。

图4 葡萄糖的标准曲线Fig.4 The standard curve of glucose

2.4 回收率实验

实验结果如表1所示，回收率满足分析要求。

表1 回收率实验结果Table 1The recovery experiment results

2.5 精密度实验

实验结果如表2所示，该分析方法有较高的精密度。

表2 精密度实验结果Table 2The precision of the result of the experiment

3 结论

实验结果表明，在碱性溶液中3，5-二硝基水杨酸被还原糖还原生成的氨基化合物在494 nm波长下具有最大吸收。采用DNS法测定甘蔗渣中还原糖的最佳条件为：检测波长494 nm，DNS试剂用量1.5 mL，沸水浴中保持5 min。本法的回收率与精密度良好，操作方便，可以应用于甘蔗渣中还原糖的测定。

[1]唐杜陵,罗嘉惠.蔗渣化学及其利用[J].化学与生物工程,1993 (4):43-45,63

[2]张木明,徐振林,张兴秀,等.预处理对稻草秸秆纤维素酶解产糖及纤维素木质素含量的影响[J].农产品加工,2006(3):4-6

[3]曲音波.纤维素乙醇产业化[J].化学进展,2007,19(7/8):1098-1108

[4]王俊刚,张淑珍,杨本鹏,等.3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定甘蔗茎节总糖和还原糖的含量[J].甘蔗糖业,2008(5):45-48

[5]韩鲁佳,闫巧娟,刘向阳,等.中国农作物秸秆资源及其利用现状[J].农业工程学报,2002,18(3):87-91

[6]陈勇,陶德欣,鲁黎明,等.DNS法测定烟草还原糖条件的优化[J].江苏农业科学,2011,39(5):393-395

[7]李卫彬,阳文辉,黄锁义,等.DNS法测定黄柏中总糖的含量[J].右江民族医学院学报,2008,30(1):13-14

[8]孙伟伟,曹伟强,王静,等.DNS法测定玉米秸秆中总糖[J].食品研究与开发,2006,27(6):120-123

Colorimetric Determination of Reducing Sugar by Methanoic Acid Pretreatment Bagasse with 3，5-Dinitrosalicylic Acid

YAN Fan-he，ZHOU Jin-mei，WU Ru-chun*
（Department of Chemistry and Ecoengineering，Guangxi University for Nationalities，Nanning 530008，Guangxi，China）

Based on DNS method，we have determined the reducing sugars content from bagasse which was pretreated with formic acid.The factors influencing on the DNS method are studied，and the optimum condition of detection was also determined：wavelength 494 nm；chromogenic agent 1.5 mL；chromogenic time 5 min，Under the optimum conditions，good results can be obtained based on DNS method.

bagasse；3，5-Dinitrosalicylic acid colormitry；reducing sugar；determination

2013-12-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.031

国家自然基金项目（21306028）；广西民族大学引进人才科研启动项目（2011QD023）

彦繁鹤（1985—），女（汉），在读硕士，研究方向：生物化工。

*通信作者：吴如春（1973—），女（汉），教授，研究生导师，研究方向：生物化工。