阴离子交换树脂法纯化透明质酸工艺的研究

王鑫，徐丽萍，王派丽

（哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

阴离子交换树脂法纯化透明质酸工艺的研究

王鑫，徐丽萍*，王派丽

（哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，黑龙江哈尔滨150076）

以鸡冠中提取的透明质酸（HA）粗提物为原料，通过静态吸附及解析试验确定选用201×7型阴离子交换树脂，通过动态吸附及解析实验，确定透明质酸最佳纯化条件为：HA粗提物与树脂体积比为4∶1；吸附时间为45 min；洗脱剂浓度为0.6 mol/L NaCl溶液；洗脱流速为1.0 mL/min；洗脱剂用量与树脂体积比为4∶1。对纯化后的物质进行紫外光谱检测，结果表明纯化后物质与标准品峰型一致，证明纯化后物质为透明质酸；粗提物的纯化率为26%，纯化物的纯化率为89.43%，显著提高了透明质酸的纯化率。

透明质酸；阴离子交换树脂；纯化

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种广泛存在于鱿鱼眼、鸡冠、脐带等结缔组织基质中由N-乙酰氨基葡萄糖和β-D-葡糖糖醛酸交替聚合而成的高分子粘多糖[1]。因为HA具有较高的保湿性、粘弹性、渗透性及生物相容性，被广泛应用于临床医学及化妆品中[2]。HA还可以渗入真皮组织促进血液循环、改善组织中间代谢和营养供应，在皮肤中发挥保水、维持细胞外空间、参与角蛋白细胞变化、受体结合以及清除自由基作用，由于HA分布于体内所有组织，含量较高的有关节腔、眼及皮肤等，若出现HA减少则导致关节炎、老花眼、皮肤出现皱纹等[3-5]。因此，HA保健食品受到越来越多人的重视和接受，因为口服HA保健品是全身性作用，可由人体吸收，由真皮至表皮增加内源性HA的含量，使细胞活化，发挥全身作用，与化妆品局部使用具有明显的不同。真皮基质主要由胶原蛋白和HA等粘多糖组成，皮肤老化由于胶原蛋白产生变化所致，而胶原蛋白的改变是由于HA的减少所致[6-7]。因此，维持胶原蛋白的功能就必须补充HA。口服HA可补充体内HA的不足，预防组织和细胞老化，特别是维持老年人的健康具有特殊的功能。因此对HA的纯度要求较高，对HA的纯度研究受到日益广泛的关注。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鸡冠：哈尔滨南极市场；201×7阴离子交换树脂、D218阴离子交换树脂、D301阴离子交换树脂：沈阳市心西试剂厂；HA标准品：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇：天津市天力化学试剂有限公司；盐酸：哈尔滨市化工试剂厂；氯化钠：天津市北方医化学试剂厂。

紫外可见分光光度计TU-1900型：北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发器R-205型：上海申胜生物技术有限公司；电子分析天平ALC-11002型：北京赛多利斯仪器系统有限公司；电热恒温鼓风干燥机（DHG-9123A型）：上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鸡冠中HA粗提液的制备

新鲜鸡冠，用乙醇溶液浸泡24 h至鸡冠变硬，置于瓷盘中于干燥箱，干燥后粉碎。将粉状物倒入烧杯中，按其质量加入6倍～7倍蒸馏水，搅拌均匀，静置浸泡过夜，收集滤液，将滤液不断搅拌加入10%的固体氯化钠，完全溶解后，加入等体积的氯仿、正丁醇溶液（氯仿：正丁醇为4∶1），搅拌3 h左右，采用分液漏斗分层取上层水相，取20 mL上层水相于烧杯中，加入90%乙醇溶液，按照1∶2体积比的例将二者混合静置沉淀24 h，回收乙醇溶液，沉淀物干燥后即为HA粗品，将其溶于蒸馏水中即为HA粗液。

1.2.2 标准曲线的绘制及样品浓度的测定

准确称取0.025 0 g经105℃干燥至恒重的HA标准品于25 mL容量瓶中，水溶解定容。分别量取HA标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置10 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，得到一系列浓度的HA标准溶液。以蒸馏水为空白，在198 nm波长处分别测定吸光度A。以吸光度为纵坐标，HA浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算HA浓度，计算出HA的含量。

1.2.3 树脂的预处理

将树脂浸泡在2倍体积10%的乙醇溶液中24 h，用去离子水洗至中性，用6.0 mol/L盐酸溶液浸泡24 h，去离子水洗至中性，用10%的盐酸溶液以2 BV/h流速通过树脂层，去离子水洗至中性备用。

1.2.4 树脂的筛选

1.2.4.1 静态吸附实验

准确称取经预处理的10 g 201×7、D218、D301阴离子树脂，加入10 mL的HA提取液，于25℃振荡24 h（振荡频率110 r/min），充分吸附后过滤，计算滤液中HA浓度，并按下式算出树脂的吸附率：吸附率=

式中：C0为吸附前溶液的浓度，（mg/mL）；Ce为吸附后溶液浓度，（g/L）。

1.2.4.2 静态解析实验

将已吸附的树脂过滤抽干，加0.5 mol/L的NaC1溶液50 mL于树脂中，室温下连续振荡24 h，收集解析液，测定滤液中HA浓度，根据下式计算树脂对HA的解析率：

式中：C1为解吸后溶液浓度，（mg/mL）；V1为解吸后溶液体积，mL；C0为吸附前溶液浓度，（mg/mL）；Ce为吸附后溶液浓度，（mg/mL）；V为吸附液体积，mL。

1.2.5 树脂对HA的动态吸附试验

将处理好的树脂湿法装入内径为2 cm，长为60 cm的树脂柱后，加入一定量的HA粗提液，调节流速，吸附一定时间后，测定流出液的HA浓度，计算吸附率。再加入一定浓度的NaCl作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，测定HA浓度以确定回收率。

1.2.6 紫外分光光度法检测HA

将HA标准品与纯化样品在波长190 nm～600 nm范围内扫描，比较标准品与样品的出峰位置及峰形。

2 结果与讨论

2.1 HA标准曲线的绘制与分析

HA标准曲线见图1。

图1 HA标准曲线Fig.1 Standard curve of hyaluronic acid

由图1可知标准曲线的回归方程为y=1.457 1x-0.007 1，相关系数R2=0.998 3，在HA浓度为0.000 0～0.300 0 g/L的范围内HA浓度与吸光度之间有良好的线性关系。

2.2 树脂筛选结果分析

选择3种类型的阴离子树脂进行筛选，确定HA最佳纯化树脂，树脂筛选结果见表1。

由表1可知，在相同条件下201×7树脂对HA有较高的吸附量和解析率，故选择201×7树脂进行后续试验。

表1 阴离子树脂筛选结果分析表Table 1Screen results of anion resin

2.3 HA的最佳上样量的选择

选择201×7树脂进行HA纯化，考察上样量对吸附率的影响，结果见图2。

图2 HA粗提物上样量对吸附率的影响Fig.2 Influence of HA crude extract on the adsorption rate

由图2所示，流出液中HA的含量随着上样量的增加而增加，上样量在1∶1到3∶1之间上升缓慢，此阶段为吸附过程，上样量超过3∶1后吸附透过曲线徒然上增饱和点为4∶1，此时树脂柱完全吸附饱和，之后随着上样量的增加吸附曲线呈下降趋势，因为此时的HA有部分损失，使相互作用的范德华力减少。因此，为了减少泄露，在增大HA得率的同时增加上样量，最佳比值为HA粗提物与树脂比值为4∶1。

2.4 HA最佳吸附时间的选择

将HA粗提物与树脂比值确定为4∶1，考察吸附时间对吸附率的影响，结果见图3。

图3 吸附时间对吸附率的影响Fig.3 Influence of eluent time on the adsorption rate

如图3所示，静置时间为30 min～45 min时曲线呈上升趋势，静置45 min时解吸率达到最大值，而后曲线呈下降趋势。时间过短吸附不完全，HA成分随之流出，因而吸附率较低。而时间过长又将难以吸附。原因是吸附是以物理吸附为主、伴随化学吸附的过程，此过程进行的较慢，当时间45 min时吸附即达到平衡。为节省时间，选取静置时间45 min为吸附最佳时间。2.5HA的洗脱剂最佳浓度的选择

将HA粗提物与树脂比值确定为4∶1，吸附时间45 min，考察洗脱剂浓度对解析率的影响，结果见图4。

图4 洗脱剂浓度对解析率的影响Fig.4 Influence of eluent concentration on the adsorption rate

如图4所示，当NaCl溶液浓度为从0.3 mol/L升至0.6 mol/L时，洗脱液中HA含量升高并达到最大；当NaCl溶液浓度高于0.6 mol/L时，随着NaCl溶液浓度的增大而降低。由于高浓度的洗脱液中的阳离子中和了树脂中的阴离子使呈酸性的HA大量洗脱出来，但是在洗脱剂浓度为0.6 mol/L时达到饱和状态，因此再增加洗脱剂浓度反而使多余的阳离子中和了HA的酸性基团导致洗脱出的HA得率下降，因此确定HA纯化最佳洗脱浓度为0.6 mol/L。

2.6 HA的洗脱剂最佳流速的确定

将HA粗提物与树脂比值确定为4∶1，吸附时间45 min，洗脱剂NaCl溶液浓度为0.6 mol/L，考察洗脱流速对解析率的影响，结果见图5。

图5 洗脱剂流速对解析率的影响Fig.5 Influence of eluent speed on the adsorption rate

如图5所示，洗脱剂洗脱流速由0.5 mL/min到1.0 mL/min时，HA解析率增长缓慢；当洗脱剂流速超过1.0 mL/min时，HA解析率下降并下降较快；由于以较低流速通过树脂时与HA提取液有充足的接触时间，使HA充分的解析出来，但是随着流速的增加通过速度加快，导致部分洗脱剂未与HA提取液充分接触即流出树脂柱导致HA的解析率下降，离子交换过程中必须使固液两相有充分的接触时间，如果液相流速增加，固液接触时间缩短，树脂与上样液就来不及交换，较快的流速不利于吸附的进行，理论上讲流速越慢吸附进行的越完全。为了进行有效的交换故应采用较低的流速。但过慢会延长生产周期，从而提高成本。因此，综合考虑，洗脱剂流速在1.0 mL/min时为最佳洗脱流速。

2.7 HA的洗脱剂最佳用量的确定

将HA粗提物与树脂比值确定为4∶1，吸附时间45min，洗脱剂NaCl溶液浓度为0.6 mol/L，洗脱流速为1.0 mL/min，考察洗脱剂用量对解析率的影响，结果见图6。

图6 洗脱剂用量对解析率的影响Fig.6 Influence of eluent dosage on the adsorption rate

如图6所示，当NaCl溶液用量与树脂体积比为由1∶1升至1∶2时呈明显上升趋势，由1∶2升至1∶3时增长速度缓慢但达到最大值得到最高的HA的解析率，继续增加二者比值，HA的解析率逐渐下降，由于洗脱剂为流动相，是携带被测的HA流出的载体，洗脱剂用量较小时只有部分HA被带出，导致部分流失，而在洗脱剂与树脂体积比达到4∶1时所通过的HA粗提液中的HA被全部带出，得到最优的解析率，因此确定HA纯化洗脱剂NaCl溶液用量与树脂体积比为4∶1。

采用最佳工艺条件纯化HA，鸡冠中HA的纯化率为89.43%。

2.8 紫外分光光度法分析HA的结果

紫外分光光度法分析HA的结果见图7。

由图7可见，样品与标品的出峰位置及峰形一致，可确定本实验纯化物质为HA。

图7 HA标准品和样品吸收光谱Fig.7 Absorption spectrum of the HA standards and samples

3 结论

采用离子交换树脂法对提取的HA进行纯化。并对纯化后的HA进行了定性定量研究。通过对HA静态吸附及解吸试验，确定201×7阴离子交换树脂为最佳纯化树脂。通过单因素实验确定了树脂纯化HA的最佳条件为：HA粗提物与树脂体积比为4∶1；吸附时间为45 min；洗脱剂为0.6 mol/L NaCl溶液；洗脱流速为1.0 mL/min；洗脱剂用量与树脂体积比为4∶1。纯化后HA的纯化率为89.43%。对纯化后的物质进行紫外光谱法检测，结果表明纯化后物质与标准品峰值位置一致，确定纯化后的物质为HA。

[1]虞菊萍,高向东.透明质酸精制方法的比较[J].药学与临床研究, 2007,15(4):300-302

[2]Karen L Goa,Paul Benfield.Hyaluronic Acid[J].Drugs March，2004, 47(3):536-566

[3]郭凤仙,凌沛学,郭学萍.透明质酸的生理功能及其在化妆品和美容保健品中的应用[J].中国协办工业,2002(9):45-46

[4]刘正平,汪冰.透明质酸的临床研究新进展[J].食品与药品,2006, 8(12):8-10

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[6]张延坤,金镜顺.一种功能性化妆品——透明质酸[J].日用化学工业,2004,34(2):111-114

[7]施昌松,崔凤玲,张洪广,等.化妆品常用保湿剂保湿吸湿性能研究[J].日用化学品科学,2007,30(1):25

Purification Technology of Hyaluronic from Acid with Anion Exchange Resin

WANG xin，XU Li-ping*，WANG Pai-li
（Key Laboratory of Food Science and Engineering，School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

The hyaluronic acid extracted crude extract used as raw material.Through static adsorption and resolution test determine to use 201×7 anion exchange resin，By dynamic adsorption and analytical experiments，the best purification conditions of hyaluronic acid were determined as follows：liquid dosage and resin adsorption volume ratio of 4∶1；the adsorption time is 45 min；the concentration of eluent is 0.6 mol/L sodium chloride solution；the speed of elution is 1.0 mL/min；dosage of eluent and resin volume ratio of 4∶1.Through ultraviolet spectrometry detection to test substance of ion exchange resin after purification，the results showed that the purified substance and the standard peak position is consistent，proof the substance after purified was hyaluronic acid；the purification rate of crude extract was 26%，the purification of the purification rate was 89.43%，the purification rate of hyaluronic acid was improved significantly.

hyaluronic acid；anion exchange chromatography；purification

2014-02-08

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.02.011

哈尔滨商业大学大学生创新训练项目（201310240092）

王鑫（1984—），女（汉），讲师，在读博士，研究方向：食品质量与安全、农产品加工及贮藏。

*通信作者