G6PD 缺乏症单细胞SNaPshot基因诊断方法的建立

吴彤华，成金泉，朱元昌，黄菊，马珍珍，尹彪，曾勇＊，蔡应木

（1.汕头大学医学院，汕头 515041；2.深圳中山泌尿外科医院生殖医学中心，深圳 518045；3.深圳中山生殖与遗传研究所，深圳 518045；4.深圳市围着床期生殖免疫重点实验室，深圳 518045；5.汕头大学医学院第一附属医院检验科，汕头 515041）

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症是人类最常见的酶缺陷病之一，全球约4亿人受累［1］，我国南方是高发区之一。该病为X 连锁不完全显性遗传，临床表现具有高度异质性，发病的主要表现为溶血性贫血和由此而产生的以未结合胆红素升高为特点的高胆红素血症，成年患者最严重的威胁是出现急性肾衰竭，而新生儿期发病则可导致核黄疸，造成永久性神经系统损伤甚至死亡，是联合国卫生组织6种主要应该预防和控制的遗传病之一，亦是广东省及深圳市出生缺陷干预工程的干预病种之一。

植入前遗传学诊断（PGD）是在胚胎植入子宫前进行的最早期的产前诊断。性连锁遗传性疾病既往一般通过PGD 性别选择来避免有表型的患者出生，但只有针对致病基因进行检测才能最为有效地阻断垂直传播，实现优生目的。随着越来越多的特异性诊断技术用于PGD，近年性连锁遗传性疾病进行特异性植入前遗传学诊断的比例逐渐增加［2］，但目前仍较少有针对G6PD 基因进行PGD 的报道，故建立准确的单细胞G6PD 基因诊断技术意义深远。多重SNaPshot技术是近年分子遗传学领域用于分析已知单核苷酸多态性（SNPs）位点的先进技术，其结合了PCR 技术和荧光光谱技术的优势，具有快速、高灵敏度、高准确度、高通量等特点［3］，使其应用到PGD 成为可能。本研究拟采用巢式PCR 对深圳不孕症人群G6PD 基因突变高发的外显子2、9、11、12［4］进行扩增，通过多重SNaPshot技术对12个突变位点同时进行基因分型，探讨临床开展G6PD 缺乏症PGD 工作的可行性。

材料与方法

一、细胞来源

根据深圳地区不孕人群G6PD 基因突变频率的高低次序［4］，选取最常见的3 种突变类型的G6PD缺乏症女性患者和正常女性各1 例（共4 例），抽取其外周静脉血，并经测序方法再次确认其G6PD 基因型。

二、实验方法

1.单细胞模板制备：抽取外周静脉血2 ml，EDTA-K2抗凝，用淋巴细胞分离液（上海恒信化学试剂）通过密度梯度离心法分离得到外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），经洗涤液（含10g／L 人血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）洗涤后制成PBMC 悬液，在倒置显微镜下吸取单个淋巴细胞，依次移入3 个洗涤液微滴中吸洗。将洗涤3次后的单个淋巴细胞转入含5μl碱性裂解液［200mmol／L KOH，50mmol／L DTT（Sigma-Aldrich，美国）］的0.2ml灭菌薄壁PCR 反应管中，同时取最后一次洗涤该单个细胞的洗涤液移入另一含5μl碱性裂解液的PCR 反应管中作为阴性对照。65 ℃加热10min裂解细胞后加入5μl中和液［200 mmol／L tricine（Sigma-Aldrich，美国）］。

2.引物设计合成：巢式PCR 引物和多重SNaPshot延伸引物设计采用Primer3 在线引物设计软件完成，由上海生物工程公司合成，序列见表1。

3.巢式PCR：（1）单管多重外侧扩增反应总体积为50μl，内含1×Hot Start Taq PCR 缓冲液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，Exon 2 OUT F／R 和Exon 9-13OUT F／R 各0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德国）和10μl裂解模板液。热循环参数：96 ℃预变性5 min；94 ℃30s，56 ℃30s，72 ℃90s，40 个循环；72 ℃延伸7min。（2）内侧扩增反应分Exon 2IN、Exon 9IN 和Exon 11-12IN 三管独立扩增，每管总体积为50μl，内含1×Hot Start Taq PCR 缓冲液，1.5 mmol／L Mg2＋，0.2 mmol／L dNTP，相 应 的Exon IN F／R 0.2μmol／L，1U Maxima Hot Start Taq酶（Fermentas，德国）和3μl外侧扩增产物。热循环参数：94 ℃预变性5min；94 ℃30s，（Exon 2 IN 为52 ℃，Exon 9IN 为60 ℃，Exon 11-12IN 为56 ℃）30s，72℃60s，35个循环；72℃延伸7min。（3）内侧扩增PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统下观察结果并记录。（4）使用QIAquick PCR Purification Kit（Qiagen，德国）按说明书要求进行内侧扩增产物纯化。

4.单管12重SNaPshot基因分型：（1）延伸反应总体系为10μl，包括纯化后产物3μl、无核酸酶的去 离 子 水3.25 μl、5×Seq 缓 冲 液1.5 μl、SNaPshot®Multiplex Mix（Applied Biosystems，美国）1.25μl、5μmol／L SNaPshot引物混合物（95、871、1004、1024、1311、1360、1376、1381、1387、1388、1414和IVS-1193）1μl。热循环参数：96 ℃10s，50 ℃5s，60 ℃30s，25 个循环。（2）10μl延伸产物中加入1USAP（Takara，日本）经37 ℃60min，75 ℃15 min 进行纯化。（3）每反应体系中加入Hi-DiTMFormamide（Applied Biosystems，美 国）9μl、GeneScanTM-120LizTMSize Standard（Applied Biosystems，美国）0.5μl和已纯化延伸产物1μl，95 ℃变性5 min，立即置于冰上5 min 后于AB 3500遗传分析仪（Applied Biosystems，美国）进行毛细管电泳。应用GeneMapper V4.1软件进行数据分析，根据SNaPshot产物中各峰的位置确定该延伸产物对应的突变位点，根据峰的颜色可知掺入的碱基种类（绿色为A、蓝色为G、黑色为C、红色为T）。只在某个突变位点对应的峰位置出现野生型颜色的峰则表明该位点为野生型；只出现突变型颜色的峰则表明基因型为纯合突变型或半合子；同时出现野生型和突变型颜色的峰则表明该基因型为杂合突变。两个或以上位点出现突变型颜色的峰表明存在复合突变。

结 果

共获得166 个单淋巴细胞（58 个为正常基因型，108个为G6PD 基因突变杂合子），其中151个细胞（52个正常，99个杂合子）扩增成功，扩增效率为90.97%（151／166）。

成功扩增的99个杂合子单淋巴细胞中有8个细胞在基因分型时在相应突变位点处仅见单峰而未观察到杂合双峰，表明PCR 过程中发生等位基因脱扣（allele drop out，ADO）现象，ADO发生率为8.08%（8／99）。

各类淋巴细胞实验结果见表2。

166例阴性对照均未发现阳性扩增。内侧扩增反应PCR 产物琼脂糖电泳结果见图1。正常单细胞检测G6PD 基因12 个突变位点的峰位置和野生型的峰颜色详见图2。各突变杂合子及其野生型等位基因发生脱扣的SNaPshot图谱见图3；各突变杂合子突变型等位基因发生脱扣的SNaPshot图谱和正常样本相同。

图1 内侧扩增反应PCR 产物2%琼脂糖电泳图

表2 单个淋巴细胞分析结果

图2 正常单淋巴细胞G6PD 基因12 个突变位点SNaPshot分型图谱

图3 杂合子及其野生型等位基因发生脱扣的SNaPshot分型图谱

讨 论

G6PD 缺乏症属于遗传性疾病，目前尚无有效的根治方法，重在预防。通过对G6PD 缺乏症患者进行遗传咨询、产前诊断，对子代进行有效预防与及时处理，可减轻本病对新生儿的危害，降低新生儿出生缺陷率，达到优生优育、提高出生人口质量的目的。PGD 是辅助生殖技术与遗传学诊断技术相结合的产物，将对遗传疾病诊断的时机提前到胚胎发育的最早阶段，选择正常胚胎植入母体子宫，从而阻断单基因疾病及染色体异常的患儿出生，这样既可避免遗传病的垂直传播，又可以避免流产和治疗性引产给夫妇双方带来的身体和精神上的创伤，已成为一个更易为人们所接受的产前诊断技术［5］。

G6PD 缺乏症作为一种全球高发病率的单基因遗传病，既往一般通过性别选择以避免有表型的患儿出生，但存在以下问题：（1）若父方正常、母方为致病基因的杂合子，生育后代时无论男女都有可能携带致病基因，以往通过PGD 选择女性胚胎移植的做法存在重大缺陷：①淘汰的男性胚胎中有50%可能为正常基因，造成了正常胚胎的浪费；②女性胚胎中有50%为杂合子，致病基因还可能遗传给下一代，并未能从根本上切断致病基因的遗传；③国内外报道均早已证实女性杂合子个体可发病［6-7］，且杂合子是新生儿高胆红素血症发生的独立危险因素之一［8］。（2）若父母双方均携带G6PD基因突变，其后代无论性别均有50%为G6PD 缺乏症患者，行性别选择不能避免该类患者的出生。对于这些情况，须通过G6PD 基因诊断才能确诊胚胎是否正常。

G6PD 缺乏症的分子基础为基因突变，全球已报道突变类型超过180 多种，其中8.0%为复合突变［9］，中国人群已发现28种突变［10］。β地中海贫血的分子基础亦是多种类型的基因突变，目前其PGD方法主要是反向斑点杂交［11］，该方法可同时检测多个突变位点，但存在如操作繁琐、耗时长，探针设计难度大，膜条制备及杂交过程中易产生非特异杂交信号而影响结果判读等缺点。SNaPshot技术即单核苷酸延伸法，又称微测序法，是以Sanger双脱氧链终止法原理为基础，以扩增出含SNPs位点的PCR 产物为模板，在紧邻SNPs位点的上游或下游设计引物，四种双脱氧核苷酸分别标记不同颜色的荧光染料，在DNA 聚合酶作用下，引物延伸一个碱基即终止，经毛细管电泳后进行片段分析，相当于单个位点的微测序，检测单核苷酸的突变：延伸位点碱基的类型决定电泳峰的颜色，延伸引物的片段长度决定峰的位置。通过设计不同长度的引物可实现多个已知SNP位点同时检测，且不管SNP位点是G／C、A／T、G／A、C／T，还是插入／缺失多态，都可以放在一个体系中检测。另外，荧光检测最突出的优点是敏感性极高，等位基因检测的信号只有另一个等位基因的1%甚至更少时，都能检测出来，从而减少ADO 现象引起的误诊。微测序技术因其高灵敏度、可自动化、结果容易判读等优势，已逐步被应用到多种遗传病的PGD 中［12］。

我们已成功运用多重SNaPshot 技术建立G6PD 缺乏症基因诊断方法［13］，在此基础上结合巢式PCR 扩增G6PD 基因突变高发的外显子，成功实现单细胞水平上对G6PD 基因12个突变位点的检测，扩增效率为90.97%，符合欧洲人类生殖与胚胎医学会（ESHRE）对PGD 的扩增效率不低于90%的 要求［14］。该SNaPshot法G6PD 缺 乏 症PGD 体系从裂解细胞到获得最终诊断结果全程仅需7h，满足无论卵裂期还是囊胚期胚胎活检都能进行新鲜胚胎移植的时效性要求，无需像运用全基因组扩增或反向点杂交等方法进行囊胚期PGD 时因有过夜的实验流程而冻融胚胎，有效避免对活检后胚胎进一步的不必要损伤。为了解该多重SNaPshot PGD体系的可靠性，本研究根据深圳地区不孕人群G6PD 基因突变频率的高低次序［4］，选取了最常见的3种突变类型的杂合子进行单淋巴细胞G6PD 基因突变检测，证实该体系可以检出这几种突变类型，ADO发生率为8.08%，满足ESHRE 关于PGD 的ADO 率 低 于10%的 要 求［14］。另 外，该 方 法 检 测G6PD 基因突变高发的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四个外显子上共12 个突变位点，但实际G6PD缺乏症PGD工作中无需全部检测，可根据夫妇双方已确诊的G6PD基因型，仅针对发生突变的位点扩增其所在的外显子并进行微测序，节约试剂成本。

本研究建立的单细胞G6PD 基因诊断方法除具有上述优势外，还因应用SNaPshot技术具有以下优点：（1）结果清晰直观，易于判读及分析，峰的位置对应突变的位点，峰的颜色对应碱基种类；（2）对扩增产物进行各位点的微测序，准确性及特异性与金标准测序法相当；（3）等位基因选择性扩增是单细胞PCR 特有现象之一，SNaPshot方法检测的是荧光信号，灵敏度高，可有效减少弱扩增的等位基因漏检，降低ADO 发生率；（4）成本低廉，约为50元／标本，且可通过选择购买大包装试剂或使用更小的反应体系令成本进一步下降；（5）操作简单、快捷、自动化程度高；（6）鉴于实验过程中如果PCR 扩增产物纯化不够可能会影响检测结果［13］，对于内侧扩增产物本研究改用柱纯化取代传统SNaPshot技术选用的SAP 及Exon I酶纯化，有效避免酶质量批间差异对纯化效果的影响并缩短实验时间，更好地保证结果的准确性和时效性。

本方法亦存在不足之处：（1）G6PD 基因突变遍及除Exon 1 外所有的外显子［1］，但本研究建立的PGD 方法仅针对突变高发的Exon 2、Exon 9、Exon 11和Exon 12四个外显子，在中国和深圳人群中分别约有7%［15］和2%［4］的G6PD 缺 乏症患者其基 因突变是在其余外显子上，该小部分患者暂不能通过该方法进行PGD，这也是本课题组后续研究的内容。（2）结果检测需要特殊设备，遗传分析仪较为昂贵。但α 地中海贫血PGD 亦使用相同的仪器平台［16］，故在具PGD 资质的生殖中心该仪器的普及率相对较高，不会对该方法的应用推广造成太大的影响。

本实验通过多重巢式PCR 和SNaPshot微测序技术，在单细胞水平上同时扩增4个G6PD 基因突变高发外显子，一次实验即可快速、准确地实现12个突变位点检测，该法有望被具有PGD 资质的生殖中心采用，取代传统的性别选择，实现对G6PD缺乏症患者真正意义上的植入前遗传学诊断。

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