子宫内膜异位症合并不孕者STAT3基因多态性分析

黄蓉，陈亦欣，王玲，许世艳，宋丽杰，王沙燕

（1.深圳市人民医院妇产科，深圳 518020；2.深圳市人民医院肿瘤研究所，深圳 518020；3.深圳市人民医院法医物证中心，深圳 518001）

子宫内膜异位症（EMs），即有生长功能的内膜组织出现在宫体肌层以外的部位［1］。EMs是育龄期妇女多发病，据文献报道，其发生率为6%～10%［2］，而在不孕症妇女中，EMs的发生率更是高达45%～50%［3］。异位内膜周期性出血会导致育龄期女性不孕［4］。有研究表明［5］，EMs的发病机制与患者的在位内膜特征有关，即基因差异所致的内膜差异导致了EMs的发生。近年来，随着生命科学的飞速发展，发现单核苷酸多态性（SNP）是导致不同个体间遗传差异的主要原因［6］。此外，EMs的发病与肿瘤的发病转移十分相似，都表现出细胞的恶性增殖和血管的新生等过程。信号转导和转录激活因子-3（STAT3）存在于多种细胞组织中，与细胞的增殖、分化、侵袭和凋亡等密切相关［7-8］。本研究采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCRRFLP）对两组妇女进行STAT3基因多态性检测，以探讨其与子宫内膜异位症合并不孕症发病机制之间的关系。

资料与方法

一、研究对象

选取2013年6月至2014年6月深圳市人民医院收治的子宫内膜异位症合并不孕症妇女30例，作为病例组；选取同期体检健康的妇女35例，作为对照组。年龄21～35岁，平均年龄（24.53±3.55）岁，汉族。两组研究对象，年龄和民族等一般资料比较无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。所有研究对象术前均未行激素治疗，此外没有其他内科合并症。本研究严格遵守赫尔辛基人体医学研究伦理，所有研究对象均在知情同意并签署知情同意书的情况下参与研究。

二、研究方法

1.主要仪器和试剂：凝胶成像仪（BioRad，美国），基因扩增仪（Eppendorf，德国），TaqDNA 聚合酶（Invitrogen，美国），HaeⅢ内切酶、Taqman SNP试剂盒（Takara，日本），PCR 引物由上海生工生物公司提供。

2.取样和DNA 提取：在无菌操作下，采集病例组及正常对照组妇女外周静脉全血5 ml，加入内置有0.85 ml枸橼酸钠的试管中，混匀后保存于4℃冰箱备用。采用蛋白酶K 消化-饱和氯化钠盐析法提取两组对象外周静脉血中白细胞的DNA。

3.STAT3多态性位点选择：根据HapMap 数据库中STAT3基因的中国北方汉族人群的数据，利用Haploview 软件，通过htSNPs（haplotype tag singlenucleotide polymorphisms）的方法对STAT3基因上的SNP 位点进行筛选，最终确定了rs2293152多态性位点。筛选标准：①所选SNP 杂合度应大于8%；②选择具备内切酶位点，酶切产物能经电泳分离的SNP；③所选SNP 位点存在可用于PCR 引物的序列。

4.PCR-RFLP检测基因多态性：据文献［9］调研，引物为5’-TCCCCTGTGATTCAGATCCC-3’，3’-CATTCCCACATCTCTGCTCC-5’。PCR 扩增参数：94℃预变4 min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环30 次，最后72℃延伸10min。扩增结束后，对扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，采用BioRad凝胶成像仪观察并分析结果。取PCR 扩增产物，用HaeⅢ内切酶酶切。酶切产物进行5%的琼脂糖凝胶电泳，采用BioRad凝胶成像仪观察并分析结果。

三、统计学分析

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。两组率比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SATA3（rs2293152）位点PCR 产物验证

PCR 扩增产物电泳分析，可见单一特异性目的片段，未见其它非特异性片断混杂。rs2293152位点PCR 产物长度为233bp，与理论产物长度相符。

二、STAT3基因多态性分布比较

STAT3基因rs2293152 多态性位点的3 种基因型为CC／CG／GG。C 和G 等位基因频率在观 察 组 和 对 照 组 分 别 为70.0%、30.0% 和90.0%、10.0%，两者相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。观 察 组CC 纯 合 型17 例，CG 杂 合型8例，GG 纯 合 型5 例，分 别 占 总 数 的56.7%、26.7%和16.6%；对 照 组CC 纯 合 型30 例，CG杂 合 型3 例，GG 纯 合 型2 例，分 别 占 总 数 的85.7%、8.6%和5.7%。两组间差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。此外，与CC 基因型相比，携带G 等位基因的基因型（CG＋GG）可能增加了子宫内膜异位合并不孕症的发病风险［OR＝4.59，95%CI（1.40，15.09）］。

图1 SATA3（rs2293152）位点PCR 产物电泳图

表1 观察组和对照组妇女等位基因频率比较［%（n）］

表2 观察组和对照组妇女STAT3基因型分布［n（%）］

讨 论

EMs是育龄期妇女多发病，异位内膜周期性出血会导致育龄期女性不孕。大量研究表明，EMs的发病具有家族遗传性，提示EMs可能是一种多基因遗传病［10］。所以，探讨EMs合并不孕症的遗传易感基因具有十分重要的临床意义。通过文献调研，我们发现STAT3与EMs的发病存在一定的相关性。有研究表明，EMs患者异位内膜组织STAT3的水平明显高于在位内膜［11］。此外，STAT3 还参与了对子宫内膜蜕膜化的调控，从而对受孕起着重要作用［12］。STAT3存在于多种细胞组织中，能够通过对信号转导及转录的调控而影响一系列基因的表达，如对cyclin D1、bcl-xL、VEGF和bcl-2等的表达，STAT3参与了细胞的增殖、分化、侵袭和凋亡等过程［13-14］。不同个体间基因组序列只存在极小的遗传差异，最常见的就是SNPs。SNPs是人类基因组脱氧核糖核酸序列中十分常见的变异形式，决定了不同个体对疾病易感性和药物反应的差异。有报道指出，STAT3基因rs2293152多态性位点与多种疾病相关。谢佳新等［15］通过对1 021例肝细胞癌患者的研究，发现rs2293152多态性可能增加了肝细胞癌的患病风险。本研究通过对30例子宫内膜异位症合并不孕症妇女STAT3基因rs2293152多态性位点的研究，发现观察组和对照STAT3 基因rs2293152多态性位点的C、G 等位基因频率存在显著性差异（P＜0.05）；三种基因型CC／CG／GG 在观察组和对照组的分布也存在明显差异（P＜0.05）；此外，与CC基因型相比，携带G 等位基因的基因型（CG＋GG）可能增加了子宫内膜异位合并不孕症的发病风险。研究结果提示STAT3 基因rs2293152多态性可能与子宫内膜异位症合并不孕症的遗传易感性相关。

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