耐喹诺酮的铜绿假单胞菌药物外排泵研究

黄 梅，奚海燕，王 颖，潘 红，范 明，胡毓安，史利宁，王卫萍，邵海枫

·论 著·

耐喹诺酮的铜绿假单胞菌药物外排泵研究

黄 梅，奚海燕，王 颖，潘 红，范 明，胡毓安，史利宁，王卫萍，邵海枫

目的 探讨外排系统在对喹诺酮类药物耐药的铜绿假单胞菌中所起的作用。方法 用含亚抑菌浓度（20 mg／L）外排泵抑制剂羰基氰化氯苯腙（carbonyl cyanide 3⁃chlorophenylhydrazone，CCCP）的MH平板和不含泵抑制剂的MH平板分别检测对环丙沙星的MIC值，比较MIC值是否不同；MIC值降低的菌株用RT⁃PCR检测外排泵蛋白基因表达量的变化，用PCR和测序法了解调控外排泵蛋白表达的基因是否存在改变。结果 14株铜绿假单胞菌的外排泵存在过度表达，环丙沙星的MIC值降低至原值的1／2～1／8，以mexAB⁃OprM和mexCD⁃OprJ表达增加为主，调控mexAB⁃OprM基因的MexR有V126E突变，mexCD⁃OprJ的调控基因NfxB有H109Y突变。结论 外排泵的高表达在喹诺酮耐药的铜绿假单胞菌中存在近50%，高于所见国内外的报道。该机制与药物作用靶位改变共同提高了铜绿假单胞菌对喹诺酮类的耐药，外排泵的高表达同时也提升了该菌对头孢吡肟等其他药物的耐药，是需要密切关注和采取相应措施的流行趋势。

铜绿假单胞菌；环丙沙星；左氧氟沙星；耐药机制；外排系统

铜绿假单胞菌是医院感染中常见的机会致病菌。在下呼吸道感染和重症肺炎中该菌作为病原菌是提示预后差的重要指标，尤其是多重耐药菌株的出现使治疗更为棘手。在大型综合性医院，喹诺酮类抗生素往往是治疗多重耐药菌感染的主要药物，由此导致铜绿假单胞菌对喹诺酮类抗生素的耐药率逐年上升，2010年我院耐药性监测显示铜绿假单胞菌对环丙沙星和左氧氟沙星的耐药率分别为37．4%到34．7%，2011年则分别上升至50．3%和48．9%［1］。有报道表明，铜绿假单胞菌对环丙沙星及氧氟沙星的耐药率与左氧氟沙星的消耗量密切相关，与环丙沙星的消耗量相关不密切［2］。

目前认为铜绿假单胞菌对喹诺酮类抗菌药耐药机制［3］主要是编码DNA解旋酶和拓扑异构酶IV的基因发生突变，导致喹诺酮类药物作用靶位改变；细胞膜外排泵的高表达是铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物耐药的另一因素［4］。铜绿假单胞菌最重要的外排系统属于RND家族，由3部分组成∶外膜蛋白，如OprM、OprJ、OprN等形成门通道，使药物进入菌体内；内膜蛋白，如MexB、MexD、MexF、MexY、MexK等，为主要的泵出蛋白，具有识别药物的作用，但无特异性；连接蛋白，如MexA、MexC、MexE、MexX等，能连接内、外膜蛋白，与其共同形成可能是连序的通道并开口于菌体外。以上3部分可形成MexAB⁃OprM、MexXY⁃OprM、MexCD⁃OprJ、MexEF⁃OprN等导致铜绿假单胞菌产生耐药性的主动泵出系统。MexAB⁃OprM受MexR的负调节，mexR位于MexAB⁃OprM操纵子和转录叉的上游，mexR突变增加MexAB⁃OprM的外排泵的表达量，伴发MDR（多重耐药）；MexXY⁃OprM可被抗菌药物诱导表达，受上游调控基因表达的MexZ负调控，由其过度表达可导致对青霉素、氨曲南、喹诺酮类、氨基糖苷类、红霉素和四环素等药物耐药。

MexCD⁃OprJ的操纵子受NfxB负反馈调控，一旦nfxB出现突变，可引起喹诺酮类、大环内酯类和头孢吡肟等药物的交叉耐药。MexEF⁃OprN受MexT和MvaT调控与喹诺酮、甲氧苄啶、氯霉素和亚胺培南的外排和总体调控铜绿假单胞菌致病相关。为了了解和证实外排系统在本组菌喹诺酮类药物耐药中所起的作用，本研究采用泵抑制、调控基因突变和泵表达量的变化进行研究探讨。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2012年10－12月收集我院临床分离的30株铜绿假单胞菌（非重复菌株），标本类型分别为痰液、血液、分泌物、脓液、组织和导管等。入选标准∶Vitek⁃2 Compact仪，用GN⁃13药敏卡检测，表型为环丙沙星（CIP）和左氧氟沙星（LEV）耐药，琼脂稀释法复查符合上述表型。质控菌株∶铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.2 仪器和设备 Vitek2⁃Compact细菌鉴定仪∶法国BioMerieux公司，PCR扩增仪∶德国eppendorf公司，捷达801凝胶电泳图像分析系统、Himac⁃CR21G低温高速离心机∶日本日立公司，H．SWX 600BS数显电热恒温水箱∶上海新苗医疗器械厂，DL⁃CJ⁃2N超净工作台∶哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，ABI 7500 real⁃time PCR system∶美国ABI公司。

1.3 试剂 RNAiso Plus（D9108A）总RNA提取试剂盒∶日本TaKaRa公司，iScriptTNcDNA Synthesis Kit、iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix∶美国Bio⁃Rad公司，TaqDNA聚合酶（附10×buffer和MgCl2）、dNTPs、DNA Marker∶日本TaKaRa公司，蛋白分子量标准∶加拿大Fermentas公司，琼脂糖∶美国Promega公司，引物合成与测序∶上海英骏公司。

1.4 方法

1.4.1 含CCCP的MH平板检测环丙沙星的MIC值 按美国CLSI（2012）标准琼脂稀释法（琼脂分为含和不含CCCP）检测和判读CIP对菌株MIC值。铜绿假单胞菌ATCC 27853为质控菌株，具体方法如下∶①倍比稀释法制备系列浓度梯度的抗菌药物溶液，浓度依次为1280、640、320、160，80、 40、20、10、5、2．5、1．2、0．6 μg／mL。②制备200 mg／L CCCP溶液。③M⁃H琼脂（CCCP）以蒸馏水配制为85%浓度，高压后冷却至56°C左右，每平板加入17 mL及1 mL CCCP溶液和2 mL对应浓度的药物，总体积为20 mL，CCCP浓度为20 mg／mL，药物终浓度依次为128、64、32、16，8、4、2、1、0．5、0．25、0．06 μg／mL。不含CCCP的MH药物琼脂方法同前，CCCP溶液换为1 mL蒸馏水。④挑取过夜培养的新鲜菌落配置为0．5麦氏单位浊度的菌液。⑤用无菌棉签接种新鲜配置0．5麦氏单位浊度的菌液到测试的M⁃H琼脂平板上，35℃孵箱18～24 h，读取MIC值。

1.4.2 实时荧光定量PCR检测外排系统基因表达量 在CCCP存在条件下CIP的MIC值下降的菌株采用qRT⁃PCR检测mexA、mexC、mexE和mexX 4种外排基因的表达量。方法如下∶用日本TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒按说明书操作提取细菌的总RNA，再使用Bio⁃RAD公司的iScriptTNcDNA Synthesis Kit试剂盒按说明书进行总RNA逆转录成cDNA，采用iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix试剂盒在ABI 7500 real⁃time PCR system定量分析外排系统4种基因的mRNA的表达量。所用引物（由上海英骏公司合成）见表1，铜绿假单胞菌（Pa）ATCC 27853为正常对照组，rspl基因为内参基因。反应体系∶20 μL，包括iTaqTNUniversal SYBRGreen Supermix 10 μL，上、下游引物各0．4 μL，双蒸水7．2 μL，cDNA 2 μL，反应条件∶94℃预变性30 s，94℃5 s，60℃35 s，30循环；溶解曲线为94℃15 s，60℃1 min，94℃15 s。每个样品设置3个重复孔，以rpsl基因作为内参基因。结果以2－ΔΔCt表示，其中ΔΔCt＝实验组－对照组（Ct目的基因－Ctrpsl）（Ct目的基因－Ctrpsl）。外排泵表达判定标准依据文献［5］报道，mexA大于2倍，mexC、mexE和mexX大于5倍为增加。

1.4.3 外排泵调控基因扩增 对外排泵过度表达的菌株，进行编码相应调控蛋白基因的扩增和测序。方法如下∶煮沸法提取细菌总DNA作为模板，进行mexR和mexZ和nfxB基因扩增。引物见表1。反应体系∶总反应体系50 μL，按PCR试剂说明书加样。循环参数∶94℃预变性10 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，循环30次；最后延伸72℃10 min。反应结束后取5 μL PCR产物在15 g／L琼脂糖中进行凝胶电泳。扩增产物送上海英骏公司测序，测序结果与GenBank数据库的相应基因进行比对。

表1 4种外排泵蛋白和调控蛋白基因引物

2 结 果

2.1 CCCP抑制后CIP的MIC值 共有14株菌在含CCCP的MH平板上检测CIP的MICs值较不含CCCP的MH平板下降为原值的1／2～1／8。泵抑制剂未能降低其他16株菌和质控菌株（ATCC27853）的MIC值，结果详见表2。

2.2 外排系统基因表达量变化 在上述14株菌中，外排系统mexA、mexC、mexE和mexX 4种外排基因逆转录实时定量PCR检测结果显示，以mexA和mexC基因表达增加为主，其中2株同时出现mexA和mexC表达量增加（P9、P12）；仅1株mexX高表达，未见mexE基因表达量增加；另有1株菌（P10）4种外排基因均未出现表达量增加。结果见表3。注∶mexA大于2倍，mexX、mex和CmexE大于5倍为增加

表2 14株菌CIP MIC值、外排泵蛋白和调控基因的变化

表3 外排系统基因表达结果

图1 外排泵调控基因扩增电泳图

2.3 外排泵调控基因突变 出现外排泵过度表达的14株实验菌和对照菌铜绿假单胞菌ATCC27853，均扩增出编码调控蛋白的基因mexR和mexZ和nfxB（图1），测序结果与基因库比对显示，MexAB⁃OprM高表达的菌株，调控基因mexR 377位U→A的点突变导致MexR蛋白V126E改变；MexXY⁃OprM高表达的菌株，调控基因mexZ 584位G→A点突变导致MexZ蛋白G195E改变；MexCD⁃OprJnfxB高表达的菌株，调控基因nfxB 167位A→G点突变导致NfxB蛋白D56G改变，结果见表2。

3 讨 论

为了解外排泵的过度表达是否存在于本组喹诺酮类耐药铜绿假单胞菌中，采用泵抑制剂CCCP抑制外排泵的方法进行CIP的MICs值检测，筛选出有可能存在外排泵过度表达铜绿假单胞菌。然后再用实时荧光定量PCR检测外排泵连接蛋白的基因表达量。泵表达量增加的菌株，采用扩增和测序技术分析编码调控蛋白的基因是否发生突变，使调控蛋白的阻遏作用丧失。

实验结果显示本组实验菌近一半菌株（46．7%）存在外排泵的过度表达，以MexAB⁃OprM和MexCD⁃OprJ型为主。MexAB⁃OprM过度表达所占菌株数最多。外排泵高表达的部分菌同时还存在头孢他啶敏感，而头孢吡肟的敏感性下降的非高活性头孢菌素酶介导的耐药表型，符合外排泵过度表达会同时影响对头孢吡肟的敏感性报道［9⁃10］。P28株为唯一出现MexXY⁃OprM高表达的菌株，用CCCP抑制后CIP的MIC值由耐药的8 μg／mL降至敏感折点1 μg／mL。相对于野生株较低的MIC值，在CCCP抑制外排泵后CIP的MIC值也达到了敏感折点。P10株未检测到实验设定的4种常见外排泵高表达，到目前为止，从铜绿假单胞菌中检出的外排泵已达9种甚至更多［11］，不排除可能存在其他类型外排泵的高表达。

本项研究表明，我院外排泵的高表达在喹诺酮耐药的铜绿假单胞菌中存在近50%，外排泵的高表达同时也提升了该菌对头孢吡肟等其他药物的耐药，是需要密切关注和采取对应措施的流行趋势。另外杨晓燕等［12］首次发现质粒介导的铜绿假单胞菌对喹诺酮类低水平耐药。实验室及时检出感染菌，提供可靠的药敏结果，有助于治疗方案的选择［13］。

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Study on the efflux pump of quinolone resistantpseudomonas aeruginosa drugs

HUANG Mei，XI Hai⁃yan，WANG Ying，PAN Hong，FAN Ming，HU Yu⁃an，SHI Li⁃ning，WANG Wei⁃ping，SHAO Hai⁃feng． PLA In⁃stitute of Laboratory Medicine，Nanjing General Hosptial of Nanjing Military Command，PLA，Nanjing，Jiangsu 210002，China

Objective This study aims to investigate the efflux system in fluoroquinolone resistance of pseudomonas aerugino⁃sa．Methods MIC values of ciprofloxacin were detected by MH flat containing sub⁃inhibitory concentration（20 mg／L）efflux pump inhibitor carbonyl cyanide chlorophenylhydrazone（carbonyl cyanide 3⁃chlorophenylhydrazone，CCCP）and MH flat without CCCP．Then compare the MIC．Results Efflux pump in 14 strains of pseudomonas aeruginosa was overexpressed，which were mainly mexAB⁃OprM and mexCD⁃OprJ．MIC value of ciprofloxacin decressed 1／2－1／8 times．MexR regulated by mexAB⁃OprM existed V126E muta⁃tion and NfxB regulated by mexCD⁃OprJ existed H109Y mutation．Conclusion The efflux pump is overexpressed in nearly 50%of flu⁃oroquinolone resistant strains of pseudomonas aeruginosa，which is higher than the domestic and foreign reports．The mechanism and drug target change improve the resistance of pseudomonas aeruginosa to fluoroquinolones．The overexpression of efflux pump also en⁃hance the resistance of the bacteria to cefepime and other drugs（this is not listed），which need us pay close attention and take meas⁃ures to control this trend．

pseudomonas aeruginosa；ciprofloxacin；levofloxacin；efflux system；resistance mechanis

R96

A

10．3969／j．issn．1672⁃271X．2015．06．007

∶2015⁃10⁃10；

∶2015⁃10⁃21）

210002江苏南京，南京军区南京总医院全军检验医学研究所

（本文编辑∶齐 名； 英文编辑∶王建东）