烟草中糖苷类潜香物质的研究进展

岳肖一，耿召良，梁贵林，张长云，杨春元，葛永辉，汪 冶

(1.贵州师范大学 化学与材料科学学院，贵州 贵阳 550001；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081； 3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550001)

0 引言

20世纪60年代以来各国对烟制品焦油含量限制越来越严格，发展低焦油卷烟已成为世界烟草发展的必然趋势.自2000年以来，全国卷烟焦油实测加权平均值年均降低0.42 mg/支，焦油含量得到有效控制，但也导致烟气中的香味成分减少，导致卷烟香味不足[1]，使烟用香精香料开发及香味补偿技术在当前开发低焦油卷烟中非常重要[2].香气是烟叶品质的核心内容，但游离态香味成分易挥发，留香不持久，释放不均匀，因此潜香物质引起了越来越多人的关注.潜香物质(flavor precursors)又叫香味前驱体(precursor of flavor component)，是指本身没有香味或香味不明显，但在陈化或燃烧等过程中能够降解产生香气物的物质[3].烟草中的潜香物质在烟叶生长、调制、纯化和燃烧过程中积累、转化和降解，可直接影响烟草的香气风格和品质，主要包括类胡萝卜素类、西柏烷类、赖百当类、含氮类及糖苷类等[4].

糖苷稳定性良好，能在吸烟过程中或特定条件下(酶解、水解、高温分解)分解释放香气成分，是烟叶中最重要前体之一[5-6].在美国，乙基香兰素-β-D-吡喃葡萄糖苷被允许作为香料添加到香烟中用来改善烟气[7].烟草中糖苷单体的分离鉴定和研究工作主要集中在20世纪70年代至80年代，近年来的研究也仅限于部分糖苷单体的稳定性、热裂解性及混合物添加价值研究，对于如何快速准确地获得糖苷标准品和其香气释放仍是目前研究的难点和热点.近些年来，许多研究者着重研究用更快更直接的方法分析糖苷键合态挥发性物质，以期发现潜在的香气成分[8].本文对烟草中糖苷类化合物的制备、香气释放和应用等进行了综述，为后续的烟草糖苷类物质制备及添加研究提供指导.

1 糖苷的性质

糖苷广泛分布于植物中，是植物中的重要次生代谢产物.糖苷在烟草植物体内的含量比较低，新鲜烟叶糖苷类香味前体含量最高，在调制类型不同的烟草中，烤烟中的糖苷结合态香味成分含量最高[9-10],烟草中部烟叶的含量明显高于上部、下部烟叶[11].

糖苷(glucoside)是环状糖的半缩醛羟基与另一分子化合物中的羟基、氨基等失水生成的失水产物，也称为配糖体[12]，是糖或糖的衍生物与配基通过苷键链接形成的化合物，见图1.

图1 糖苷类物质的结构示意图Fig. 1 Structural diagram of glycoside

烟草中糖苷类潜香物质的配基大多具有香气，主要有：萜烯类、C13-降异戊二烯类、苯及苯的衍生物、羟基酯类、己醇己烯醇类[13].糖基一般为单糖或双糖，三糖较少[14].这些糖苷类化合物前体一般为对应的具有芳香性的醇类化合物，在燃烧、酶解过程中，随糖苷键的断裂释放香味成分[15].

糖苷化合物根据结构特点以及性质有很多分类方法，烟草中糖苷的分类多根据实际需要进行多种分类方法交叉应用，其中苷键原子和糖的数目是应用最多的分类方法.按苷键原子的不同，可分为O-苷、C-苷、N-苷、S-苷；按糖的数目的不同，可分为单糖苷、低聚糖苷.

2 糖苷的制备方法

2.1 色谱法

国内外研究者已从不同烤烟中分离了多种糖苷单体，见表1，包括单糖苷和双糖苷，大部分为葡萄糖苷，从晾晒烟中分离糖苷的研究鲜有报道.利用色谱法能获得烟草中未知及通过合成手段不成功的糖苷，且纯度较高(多在90%以上)，但本法难度高，实验周期长.烟草中糖苷的分离为烟草香气的形成、烟草品质的评价提供了新的思路.

表1 从烟草中分离的部分糖苷类化合物

从烟叶中通过色谱法分离糖苷的过程为溶剂提取、萃取、色谱法分离、高效液相色谱(HPLC)纯化富集，见图2.糖苷极性较大，溶解度也根据苷元的性质而有较大的差异[23].根据相似相溶原理，用水或醇等强极性溶剂浸泡或加热回流浓缩后获得烟草浸膏[24].糖苷在酸性条件下发生水解，因此不建议用酸碱萃取法而是采用有机溶剂萃取法去除干扰成分.得到的浸膏利用各种常规分离手段(薄层色谱、柱色谱、重结晶等)得到糖苷细提物.使用高效液相色谱辅助分离获得糖苷类化合物的单体，并借助MS及NMR等波谱数据鉴定其苷元和糖基部分.

本课题组开展了贵州烤烟糖苷的分离鉴定，在研究过程中糖苷单体含量少，大量的烟碱干扰是分离纯化糖苷的难点.实验过程中，糖苷组分的富集十分的重要.在糖苷定性定量研究中，采用固相萃取技术，用水洗和酸洗对去除生物碱的干扰的效果较好[25]，这为去除烟碱干扰提供了研究思路.目前该法应用于糖苷分离制备中，酸碱度难以控制、成本较高、适用样品量较小.

图2烟草糖苷分离流程示意图

Fig. 2Flowdiagramofglycosideisolatedfromtobacco

2.2 有机合成法

通过有机合成法制备糖苷的研究始于1893年[26]，至今已有100多年的历史，化学合成糖苷容易控制条件而且可以广泛地应用到生产中，由于糖自身结构中存在着多个羟基和缩醛结构，使得糖苷的合成具有复杂性[27].糖苷的合成方法有：Fischer法、Koenings-Knorr法、相转移催化法、硫苷法、三氯乙酰亚胺酯法、Helferich法、4-戊烯法、原酸酯法、磷酸酯糖作为糖基供体等方法.其中应用Fischer法、Koenings-Knorr法、相转移催化法合成糖苷最为常见.

2.2.1 Fischer法

Fischer法合成糖苷的原理是低分子糖与醇在酸性催化剂(硫酸、对甲苯磺酸、烷基苯磺酸、磺酸树脂等)作用下反应生成烷基糖苷.Fischer法优点是反应条件简单、收率高，缺点是产物为多种异构体的混合物.合成方法的关键是催化剂的选择，新型催化剂的开发成为研究热点，固体超强酸催化剂SO42-/TiO[28]、己内酰胺-对甲苯磺酸离子液体[29]，都能以较高收率合成烷基糖苷.

2.2.2 Koenings-Knorr法

Koenings-Knorr法合成糖苷的原理是卤代(溴、氯代)糖与醇在重金属盐(银盐、汞盐)作催化剂条件下反应生成氧苷.该法优点是产物结构专一、收率较高，缺点是反应条件苛刻、催化剂较贵.目前已经成功合成出龙脑莰醇葡萄糖苷、马鞭草烯醇葡萄糖苷[30]、ɑ-紫罗兰醇-β-D-葡萄糖苷[31]等有香气的配基糖苷.氟代糖[32]和碘代糖[33]作为糖基供体为传统Koenings-Knorr法合成糖苷提供了新思路.

2.2.3 相转移催化法(Phase transfer catalyst，PTC)

相转移催化法合成糖苷的原理是溴代糖与酚、醇溶解在二氯甲烷与碱性溶液中在相转移催化剂条件下合成糖苷，产物为硫苷、氧苷等[34].相转移催化剂大多采用季铵盐，有四丁基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、四丁基硫酸氢铵、三乙基苄氧基氯化铵[35].该法优点是操作简单、收率较高、立体选择性好[36]，缺点是反应物不稳定，催化剂用量较多[37].目前已经成功合成出丁香基-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷、异丁香基-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷[38]、乙基香兰素葡萄糖苷[39].

产物专一的Koenings-Knorr法和相转移催化法都已经成功合成出具有潜香价值的糖苷，利用有机合成法制备糖苷建议采用相对经济的相转移催化法.但目前没有一种简单有效的方法可以绿色化、高收率地合成目标糖苷.各种糖苷合成方法应相互借鉴思路，如在Koenings-Knorr法上发展的硫苷法[40]，找到一种行之有效立体选择性好的合成方法，是未来研究化学合成糖苷的重点.

1913年，Bouquelot提出利用高效、具有立体选择性的酶作为催化剂合成糖苷，生物催化法合成糖苷优点是反应条件温和、可以得到高度选择性的产物，缺点是酶的使用寿命短、产物复杂[41-43].不同活性中心的酶作为催化剂，会表现出不同的反应原理和催化能力.常用的酶有：糖基转移酶、糖苷酶、糖苷合成酶等.立体选择性好、产率高、经济的糖苷合成酶法是制备糖苷的新选择.目前利用糖苷酶已经成功合成出橙花醇糖苷[44]、薄荷醇糖苷[45]等具有潜香价值的糖苷.目前已知的糖苷酶有2500种[46]，但是深入研究的生物酶却很少，利用生物手段合成糖苷有巨大的开发潜力.

3 糖苷的香味释放

在燃吸过程中糖苷能够均匀地增加香气是因为苷元的缓慢释放[47]，裂解是卷烟燃烧过程的一个重要环节.热分析方法是研究糖苷香味前体热裂解和香味释放的有效手段[48]，了解糖苷类香味前体的裂解方式、裂解产物有助于其在高温产品、卷烟加香的应用.目前大多数热裂解分析研究针对糖苷单体化合物，一般采取无氧在线裂解或高温熔盐法离线裂解等手段对糖苷进行热裂解，利用气相色谱-质谱仪定性定量分析热解产物.通过研究发现糖苷裂解主要是从糖苷键处断裂，从而释放出丰富的酮类、醇类、酚类有机酸等致香成分.裂解温度的选择对裂解产物的组成至关重要，不同糖苷最佳裂解温度差异很大，300 ℃左右是适合香叶基葡糖苷裂解的温度(玫瑰花香)[49]，香兰素-α-D-葡糖苷在600 ℃下产生的大量的香味成分(甜味奶香)[50]，薄荷醇糖苷释放叶醇的最佳温度是350 ℃[51].控制降解温度可以得到较多的香气物质也可使香气质量更加丰满.

4 糖苷的应用

近年来，随着消费者对卷烟制品安全性要求的提高，降低焦油含量、提高香气、降低危害成为烟草行业研究的热点[52].糖苷类潜香物质作为重要的一类香味补偿物质，引起了广大研究者研究.通过加样浓度分析、主流烟气香味成分分析、糖苷稳定性分析、逐口释放分析、感观特征评价研究表明糖苷可使卷烟香气增加，降低刺激性，提升卷烟品质(表 2).香兰素糖苷、紫罗兰醇糖苷、香叶醇糖苷对于卷烟加香应用研究的最深入.但目前只有乙基香兰素-β-D-葡萄糖苷是唯一通过美国FEMA组织评估并允许作为香料使用的糖苷化合物[53].

糖苷类潜香物质在燃吸过程中可以逐渐释放香气物质.但在裂解过程中糖苷键、糖的断裂产生了苯酚、对苯二酚等挥发性的酚类、多环芳烃等卷烟烟气中的有害成分.虽然糖苷类潜香物质能够修饰香气提升卷烟品质，但酚类、多环芳烃的含量的提高限制了其在卷烟工业中的应用[54].因此安全性是能够将其运用到工业生产的未来研究热点.

表2 评吸效果较好的部分糖苷类化合物

5 结论

通过糖苷制备方法的比对，可以看出：色谱法获得糖苷立体选择性差、难度高、实验周期长.生物酶促法合成糖苷酶的使用寿命短、产物复杂.而有机合成法由于条件容易控制、立体选择性好，因此有机合成法尤其是相转移催化法是推荐的制备糖苷的方法.

烟草中糖苷的香味释放有热裂解、酶水解等方式，但酶解法在实际应用较少.通过热裂解产物分析，在高温时糖苷键的断裂是最主要的裂解原理，从而使糖苷配体与糖基分开，释放出丰富的酮类、醇类、酚类、有机酸等致香成分.因此在烟草行业中，深入研究配体有香味的糖苷的最佳裂解温度、裂解时间、裂解协同性对发现香味补偿剂具有指导意义.

在加香评吸研究中，控制添加含量以及降低随之引发的有害烟气，是解决其在卷烟工业应用的关键问题.

研究更快速有效制备糖苷的方法，扩大在卷烟加香试验中加入糖苷的种类和研究范围.并结合生物化学、天然药物化学、微生物学等相关学科交叉渗透以及现代仪器分析手段的发展，对发现热稳定性好加香减害并能在卷烟工业生产中广泛地应用的糖苷类潜香物质是今后糖苷研究的主要方向，其应用前景十分广阔.