蒙脱石对胰岛素的吸附及其缓释性能研究

彭 琪，朱维钧，杨春柳，于永生，朱建君，杨性坤

(1.信阳师范学院 化学化工学院，河南 信阳 464000；2. 平顶山学院 数学与信息科学学院，河南 平顶山 467000)

0 引言

蒙脱石(montmorillonite, MMT)是一种生物惰性黏土类矿物质，分子式为(Al,Mg)[Si4O10](OH)2·nH2O，是由硅氧四面体和铝氧八面体所组成的2∶1型层状硅酸盐矿物，是膨润土的主要矿物成分.[1]它的化学成分相当稳定，具有无毒、耐化学溶剂、粒径小、晶层可被嵌入、比表面积大、易于吸附分子及较强的离子交换能力等特点[2]，它能将阳离子药物插入MMT片层间的空隙内，使药物能够缓慢地释放出来.[3]根据含有的可交换阳离子的种类，MMT可被分为钙基蒙脱石和钠基蒙脱石.[4]我国出产的天然黏土约90%属于钙基蒙脱石，然而钠基蒙脱石具有更好的吸附性及离子交换性.因此，在实验中开发利用MMT作为药物释放载体通常先将钙基蒙脱石提纯转化为钠基蒙脱石.[5]胰岛素(Insulin, INS)是一种在人和动物机体内的能够降低血糖的激素，在医学上主要被用于糖尿病的治疗.然而，由于胃酸的破坏、消化酶的降解及难以跨越生物膜的机械屏障作用等因素，目前，胰岛素只能以注射的形式给药，而且通常需要长期反复地频繁给药，这给患者带来了极大的痛苦.[6]为了解决以上问题，国内外的学者进行了大量有关口服胰岛素制剂的研究，包括选择可生物降解高分子材料、药物结合链断裂等手段，从而有望实现胰岛素的口服给药.[7-11]

本实验以河南信阳的钙基蒙脱石为原料，先将其转化为钠基蒙脱石，再以胰岛素为模型药物，在一定条件下制备出INS/MMT复合物，考察钠基蒙脱石对胰岛素的吸附能力，研究pH值和释放时间等因素对复合物体外释放胰岛素的影响规律，采用一级动力学模型、Higuchi模型和Korsmeyer- Peppas模型分析INS在不同pH值下的释放机理，探讨蒙脱石作为胰岛素的药物缓释载体的可行性，为进一步开发口服胰岛素制剂提供理论参考.

1 实验部分

1.1 样品制备

膨润土样品采自河南信阳.先采用湿法对膨润土原矿进行提纯，再用1 mol/L NaCl溶液对钙基膨润土进行钠化改性.提纯改性后，钠基蒙脱石中杂质的含量大大降低，测定其阳离子交换容量为72.3 mmol/100 g，吸蓝量为40.05 mL，计算后得知，提纯后钠基蒙脱石的含量约为91%，该纯度可以满足后续实验的相关要求.[12]

其他主要原料：胰岛素精粉(提取于猪胰腺，徐州万邦生化医药股份有限公司生产，27.5 IU/mg)，浓盐酸，甘氨酸，考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%磷酸，牛血清白蛋白，氨水，氯化铵.实验中所用化学试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水.

准确称取600 mg胰岛素粉末，加入到300 mL pH 3.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液中，充分溶解后加入150 mg钠基蒙脱石，搅拌9 h后离心，从中取适量滤液，稀释后在595 nm处测定吸光度.将沉淀用蒸馏水洗涤2～3次，干燥研磨后得到INS/MMT复合物，储存于干燥器中备用.[13]

1.2 性能测试

使用日本HITACHI-U3900H型UV-Vis分光光度计测定分析溶液中INS的浓度.

1.3 方法

1.3.1 标准曲线的绘制[14-15]

准确称取10 mg牛血清白蛋白，将其溶于10 mL蒸馏水，即得1 g/L的标准蛋白溶液.另准确称取10 mg考马斯亮蓝G-250，溶于5 mL95%乙醇中，加入10 mL85%(W/V)磷酸，用蒸馏水定容至100 mL，即得0.1 g/L的考马斯亮蓝溶液.精确吸取标准蛋白溶液0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL，分别用蒸馏水稀释至1 mL，再依次加入5 mL考马斯亮蓝溶液，摇匀.以不含牛血清白蛋白的试样为空白对照，在595 nm处于5 min内完成吸光度测定，并绘出标准曲线.结果表明，在0～100 mg/L范围内，吸光度与浓度之间具有良好的线性关系，其相关系数R为0.999 5.

1.3.2 MMT对INS的包封率和载药量[16]

采用下面式子计算MMT对INS的包封率和载药量.

包封率EN=m1/m2×100%,

(1)

其中：EN为蒙脱石的包封率，%；m1为复合物中包载的INS的质量，mg；m2为复合物形成后上层清液中INS的总质量，mg.

载药量DL=m1/m3×100%,

(2)

其中：DL为蒙脱石的载药量，%；m1为复合物中包载的INS的质量，mg；m3为复合物形成后上层清液中蒙脱石的质量，g.

1.3.3 INS/MMT 复合物的体外释放

准确称取3份30 mg INS /MMT复合物，分别置于pH为7.4、5.0和1.2的释放介质中，密封后置于锥形瓶中，在37 ℃下于恒温振荡器中对复合物进行体外释放试验.在适当的时间取样，同时向体系中补充等量的新鲜释放介质.用紫外可见分光光度计测定样品在595 nm处的吸光度，通过计算得出释放介质中INS的浓度和累积释放量.

2 结果与讨论

2.1 MMT对INS的包封率和载药量

由实验数据计算蒙脱石对INS的包封率和载药量，得到如下实验结果：钠基蒙脱石对INS的包封率为22.76%，载药量为910.34 mg/g.这说明蒙脱石对INS具有较强的吸附能力.[12]

2.2 INS/MMT复合物的体外释放

将复合物在3种不同pH下进行释放实验，测定了在不同取样时间下从INS/MMT 复合物中释放出的INS浓度，结果见图1.

图1 INS/MMT 复合物在不同 pH 下的释放曲线Fig. 1 The release curve of INS from the INS/MMT complexes in various pH aqueous solutions

对于在3种pH值下的缓释实验，我们采用3个理论模型：一级动力学模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型来研究INS从复合物中释放的机理.[17-20]拟合结果见图2、图3、图4和表1.其中，一级动力学模型常用于多孔骨架系统中水溶性药物的释放动力学研究，可用公式(3)表示：[17]

Qt=Q∞(1-Me-kt/Q∞).

(3)

基于菲克定律，Higuchi模型把药物的释放描述成扩散过程，是扩散型药物释放系统的典型模型，可用公式(4)表示：[20]

Qt=kHt1/2.

(4)

Korsmeyer-Peppas模型考虑到药物分子的释放机理通常并不完全符合菲克定律，而会表现出一定的无规则性，则可用公式(5)表示：[21]

Qt=kHtn,

(5)

其中：Qt是在t时刻药物累积释放的百分含量；Q∞是在平衡状态下药物释放的百分含量；M是药物的释放量；t是释放时间；k是一级释放动力学常数；kH是Higuchi扩散常数，k1是Korsmeyer-Peppas模型的动力学常数；n是释放指数.其中，当0.45

图2 一级动力学模型拟合INS在不同 pH 下的释放Fig. 2 Curve fitting of INS release rate with first order kinetics model in various pH aqueous solutions

图3 Higuchi模型拟合INS在不同pH下的释放Fig. 3 Curve fitting of INS release rate with Higuchi model in various pH aqueous solutions

由图1、图2、图3和图4可知：INS/MMT复合物中INS的释放行为受溶液pH值影响较大，当pH为7.4和1.2时，INS的释放浓度和累积释放量的最大值分别为181.71 mg/L、14.54%和177.85 mg/L、14.23%，均远大于pH 5.0时的释放情况.虽然当pH 1.2时，复合物中INS的释放累积量在12 h内明显高于pH 7.4时的结果，但由于INS在强酸性介质中存在12 h后会发生部分降解，因此测得的释放浓度在释放24 h时反而有所下降(使用紫外可见分光光度计在不同时间点对INS在3种pH下进行峰形扫描，数据未给出).由此可见，中性和强酸性条件会更有利于INS从复合物中释放出来.

图4 Korsmeyer-Peppas模型拟合INS在不同 pH 下的释放Fig. 4 Curve fitting of INS release rate with Korsmeyer-Peppas model in various pH aqueous solutions

由于胰岛素的等电点约为5.1，在pH 5.0时稍带正电荷，在pH 1.2时带正电荷，在pH 7.4时带负电荷，所带的电荷越多，蒙脱石片层间胰岛素分子间的静电排斥作用越强，从而使得INS更容易释放出来.这使胰岛素在pH 1.2时比在pH 7.4时更容易释放出来.另外，在pH 7.4时，插入到蒙脱石层间的INS与溶液中的磷酸根等阴离子间进行的离子交换作用对药物释放也有一定的贡献.[14]当pH 值在胰岛素等电点附近时，INS所带的电荷最少，复合物中INS的释放浓度和累积释放量最低.

当pH 7.4时，在释放的前12 h，复合物中INS的释放浓度和累积释放量均随时间的延长而增大.在12 h后，其释放速率逐渐变缓，释放浓度和累积释放量趋于稳定.当pH 1.2时，在7 h后，INS的释放速率就逐渐稳定下来.但是当pH 5.0时，在整个释放周期内，INS的释放曲线都很平缓，释放浓度和累积释放量均很小.由此，我们可以认为：INS/MMT复合物中INS的释放过程可分为2个阶段：第一阶段为初期，INS的释放速率相对较快，释放的可能是吸附在钠基蒙脱石表面的INS，此外由于存在复合物和释放介质间的浓度梯度，蒙脱石表面的INS会不断从复合物中扩散到溶液中.第二阶段是较缓慢的持续释放过程，此时释放的可能是插入到蒙脱石层间的INS.

将INS/MMT复合物在3种pH下的释放数据按照一级动力学方程、Higuchi和Korsmeyer-Peppas模型进行拟合，由拟合优度(R2)来判断曲线拟合情况，拟合结果见表1.由拟合结果可见，在3种不同pH下，一级动力学方程拟合的结果最好，为药物释放的最佳模型.由此可推测，当INS从复合物中释放出来时，在浓度差的作用下，蒙脱石表面吸附的INS分子迅速扩散，蒙脱石层间的INS也将通过扩散作用进入溶液.此外，在3种pH下，采用Korsmeyer-Peppas模型拟合的释放指数都小于0.45，这说明INS从复合物中的释放是基于Fickian扩散机理.

综上所述，INS/MMT复合物在中性和强酸性条件下可有效释放出INS，并使药物浓度保持恒定，因此，蒙脱石是一种性能优良的胰岛素缓释载体.这为在将来的研究中寻求一种吸附能力强、稳定性好且价格低廉的口服胰岛素制剂提供了理论依据，同时也为河南省信阳地区矿产资源的开发利用提供了参考依据.

表1胰岛素在3种pH值释放介质中释放的不同动力学模型拟合结果
Tab. 1FittingresultsofinsulinreleaseratewiththreedifferentkineticmodelsinthreepHaqueoussolutions

3 结论

本研究表明：钠基蒙脱石对胰岛素具有较高的吸附能力和缓释作用；复合物中胰岛素的释放行为受释放介质pH值的影响较显著；采用不同模型对释药过程进行拟合，结果表明一级动力学模型的拟合效果最好，这说明胰岛素从复合物中释放的行为主要由扩散作用决定.接下来，本研究将着重对如何提高药物的载药量和包封率进行深入研究.