基于酪氨酸酶/离子液体-石墨烯纳米复合界面的双酚A电化学传感器

马 勇, 李 瑞, 刘贵深, 侯晓东, 黄奕娜, 李春涯*

(1. 中国石油大学胜利学院 化学工程学院, 山东 东营 257097； 2. 中南民族大学 化学与材料科学学院, 湖北 武汉 430074； 3. 广东省潮州市质量计量监督检测所，广东 潮州 521011 )

0 引言

双酚A (Bisphenol A), 2，2-二(4-羟基苯基)丙烷(其分子结构如图1)，是重要的有机化工原料，具有类雌激素性能，摄入动物体内后，能使人类或动物体内的荷尔蒙功能和生理系统发生紊乱[1]，即使在浓度很低的情况下，仍会对生物体内激素的合成、释放和生理作用等产生影响，进而造成机体的生殖、发育及行为异常，严重时会致癌、致畸、致突变，威胁人类的健康和生存.近年来，不断有媒体报道在食品如海洋鱼类、食品包装(如婴儿奶瓶)及地表水中发现双酚A，这对人类的食品安全构成了极大危害.因此，实现对食品和环境中双酚A快速、可靠检测尤为重要.双酚A的

检测方法主要有气相色谱-质谱(GC-MS)法、液相色谱法、荧光法、极谱法及酶联免疫吸附法(ELISA)等[2-5].双酚A具有可电化学氧化的酚羟基，但其氧化电位高，且易于在电极表面聚合而污染传感界面[6-7]. 基于酪氨酸酶构建的电化学传感器能选择性识别双酚A，并将酚羟基氧化成醌类化合物，从而灵敏、准确、快速测定双酚A[8-9].

图1 双酚A的化学结构Fig. 1 Chemical structure of bispheno1 A

离子液体是由阴、阳离子组成，在100 ℃或低于此温度下熔融并以此作为特定温度界限的物质.具有蒸汽压低，电化学稳定性好，电导率高，电化学窗口大等特点[10-11].石墨烯(Graphene)被称为单层石墨，是由sp2杂化碳原子组成的呈蜂窝状新型二维原子晶体[12].石墨烯具有许多独特的物理性能，如比表面积大、高导热性、室温下内在载流子迁移率高、机械强度好等，广泛用于能源、材料、生物医药和电化学传感等领域[13-18].本文将1,3-二(4-氨基-吡啶)丙烷四氟硼酸盐离子液体修饰石墨烯修饰至玻碳电极表面，构建纳米复合界面，并用于负载酪氨酸酶以构建双酚A电化学传感器.离子液体修饰的石墨烯纳米界面不仅增大了酪氨酸酶的负载量，且能促进酶与电极间电子传递，提高传感器的安培响应，实现了双酚A的高选择性、高灵敏度检测.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660A电化学工作站，上海辰华仪器有限公司;FA2004N电子天平，上海精科；KQ-100E超声清洗器，昆山市超声清洗仪器厂；场发射扫描电子显微镜，JEOL-6700F，日本；双酚A，分析纯，阿拉丁；磷酸氢二钾，分析纯，汕头市化学试剂厂；磷酸二氢钠，分析纯，上海新华化工厂；氢氧化钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；酪氨酸酶，Tyrosinase，worthington公司.

1.2 传感器的制备

玻碳电极(Ø=3 mm)用氧化铝悬浊液抛光，并依次在丙酮、乙醇和去离子水中超声清洗，室温干燥，备用.用0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.4)配制10.0 g/L酪氨酸酶(Tyr)溶液，取100.0 mL酪氨酸酶溶液(400 units)与100.0 mL，1.0 g/L的Gr-DAPPT溶液超声混匀，取7.5 μL混合液滴涂至洁净的玻碳电极表面，4 ℃干燥，经戊二醛交联，再以去离子水彻底清洗电极表面，除去物理吸附的化学物质，得酪氨酸酶生物传感器(Gr-DAPPT-Tyr/GCE).

1.3 双酚A测定

双酚A测定采用三电极系统：Gr-DAPPT-Tyr/GCE为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极.循环伏安法电位扫描范围为-0.3～0.7 V，扫描速度为100 mV/s.在25 mL氧饱和的磷酸缓冲溶液中，以0.1 V作为工作电位实现双酚A的安培检测.

1.4 样品的制备

聚碳酸酯(PC)矿泉水瓶样品购于附近超市.剪碎后用去离子水清洗，取1.0 g样品置于50 mL乙醇中，50 ℃加热12 h，冷却后密封放置5 d.将混合物过滤，收集滤液，定容，置于冰箱中保存备用.

2 结果与讨论

2.1 形貌分析

采用扫描电子显微镜表征了Gr-DAPPT/GCE(a)和Tyr-Gr-DAPPT/GCE(b)的表面形貌(见图2).由图2可以看出，Gr-DAPPT纳米复合物在玻碳电极表面呈现褶皱状分布，有石墨烯片层结构堆叠现象；Tyr-Gr-DAPPT在玻碳电极表面的形貌迥异，石墨烯的片层结构不再清晰，却可见许多蠕虫状颗粒，为戊二醛交联负载于Gr-DAPPT纳米界面上的酪氨酸酶.

图2 Gr-DAPPT/GCE (a)和 Tyr-Gr-DAPPT/GCE (b)的扫描电镜图Fig. 2 Scanning electron microscopic images of Gr-DAPPT/GCE (a) and Gr-DAPPT-Tyr/GCE (b)

2.2 双酚A的循环伏安行为

考察了1.0×10-4mol/L双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE(a)、Tyr-GO-DAPPT/GCE(b)、Gr-Tyr/GCE(c)、Tyr/GCE(d)和GCE(e)上的循环伏安行为，如图3所示.除在GCE上无明显的氧化-还原峰外，其他修饰电极上均呈现出一对明显的氧化-还原峰，归属于双酚A经酪氨酸酶催化氧化后所得醌类化合物的氧化还原反应.其中，双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的峰电流最大，表现出显著的增敏效应.

图3 1.0×10-4 mol/L双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE (a), Tyr-GO-DAPPT/GCE (b), Tyr-Gr/GCE (c), Tyr/GCE (d)和GCE (e)上的循环伏安曲线；支持电解质： 0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(pH 7.0)；扫描速度：0.1 mV/s.Fig. 3 Cyclic voltammograms of 1.0 × 10-4 mol/L bisphenol A at the Tyr-Gr-DAPPT/GCE (a), the Tyr-GO-DAPPT/GCE (b), the Tyr-Gr/GCE (c), the Tyr/GCE (d) and the bare GCE (e) Supporting electrolyte: 0.1 mol/L phosphate buffer solution (pH 7.0); Scan rate: 0.1 mV/s.

2.3 实验条件优化

Tyr-Gr-DAPPT溶液的滴涂量不仅影响酪氨酸酶在玻碳电极表面的负载量，也影响修饰膜厚度，进而影响双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的电流响应.图3 (a)为Tyr-Gr-DAPPT溶液滴涂量对1.0×10-4mol/L双酚A的氧化峰峰电流的影响，发现滴涂量为7.5 μL时，传感器对双酚A具有最大的电流响应，故选择7.5 μL 为Tyr-Gr-DAPPT混合溶液的最佳修饰体积.

电化学测量时，缓冲溶液的pH值会影响酪氨酸酶的活性，进而影响双酚A的电流响应.在pH值4.0～9.0范围内，考察其对1.0×10-4mol/L双酚A的氧化峰峰电流的影响，如图4(b)所示.发现pH值在4.0 ～ 7.0范围内时，氧化峰峰电流随pH值增大而增加；在pH值7.0～9.0范围内，氧化峰峰电流随pH值增加而减小，在pH值7.0时，传感器对双酚A的电流响应最大，与游离酪氨酸酶活性最大时的pH值一致，表明负载过程未改变酪氨酸酶的固有性质.

图4 滴涂量(a)、pH值(b)及电位(c)对双酚A电流响应的影响Fig. 4 Effects of the volume of Gr-DAPPT-Tyr solution (a), pH values (b) and the applied potential (c) on the peak current response of bisphenol A at the Tyr-Gr-DAPPT/GCE.

安培测定时，电位会影响酪氨酸酶催化双酚A所得醌类化合物的氧化反应，进而影响检测灵敏度.在0～0.2 V范围内，考察安培检测电位对2.0×10-6mol/L双酚A的电流响应的影响.由图4(c)可知，检测电位为0.1 V时，双酚A的安培响应信号最大，灵敏度最高，故选择0.1 V为最佳安培检测电位.

2.4 安培法测定双酚A

图5 双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培响应曲线； 内插图为低浓度时的安培曲线.Fig. 5 The amperometric response of the Tyr-Gr-DAPPT/GCE with successive addition of bisphenol A to 0.1 mol/L phosphate buffer (pH 7.0) at an applied potential of 0.1 V. The inset is the amperometric curve of bisphenol A at low concentrations.

优化条件下，考察了双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培响应.如图5所示，发现双酚A在Tyr-Gr-DAPPT/GCE上的安培响应时间很短，安培响应电流(I)与双酚A浓度(c)在1.0 ×10-9～ 3.8×10-5mol/L范围内具有良好的线性关系，线性方程为：I(nA ) = 6.99c(μmol/L) + 0.565 2(R=0.999 5)，检出限是3.5×10-10mol/L (RSN=3).

2.5 重现性与选择性

以同一Tyr-Gr-DAPPT/GCE连续测定2.0×10-6mol/L BPA溶液5次，其安培响应电流值的相对标准偏差(RSD)为2.3%，具有较好的重现性；分别制备5支Tyr-Gr-DAPPT/GCE，并用于测定2.0×10-6mol/L BPA，其安培响应电流值的相对标准偏差(RSD)为3.2%，表明具有良好的制备重现性.采用安培法考察有机小分子对2.0×10-6mol/L双酚A的干扰情况，发现1.0×10-4mol/L抗坏血酸、尿酸和半胱氨酸等对双酚A检测无干扰.

2.6 实际样品测定

购买市售某型号太空杯，剪成大约1 cm碎片，洗净,干燥，称取28.0 g样品，置于250 mL圆底烧瓶中，加入乙醇，50 ℃回流反应12 h，冷却至室温；抽滤，得透明溶液，蒸干溶剂，以少量乙醇溶解，备用.以安培法测定样品溶液中双酚A浓度，并采用高效液相色谱和加标回收法验证方法准确性，如表1所示，结果表明Tyr-Gr-DAPPT/GCE能够准确、可靠测定实际样品中双酚A.

表1 实际样品中双酚A测定结果

3 结论

基于石墨烯-离子液体纳米复合物负载酪氨酸酶构建生物传感界面，并用于双酚A的电化学检测.结果表明，石墨烯-离子液体纳米复合物不仅能增加酪氨酸酶的负载量，且能有效促进其对底物的催化效率，实现高灵敏电化学响应.该传感器用于双酚A安培检测，具有灵敏度高、重现性、选择性好等特点，并可实现实际样品中双酚A测定.