莫扎特K.448对颞叶癫痫模型鼠高频脑电活性的影响

周 佩，张曼宁，张 瑶，刘 飒，李胜天*

(上海交通大学 a.Bio-X研究院；b.生物医学工程学院，上海 200240)

0 引言

癫痫(epilepsy)是常见的神经系统疾病之一，表现为脑内神经元高度同步化异常放电所引起的短暂脑功能失调综合征，其特征是反复发作.根据世界卫生组织报道，全球大约有5千万人遭受癫痫的折磨[1].目前治疗癫痫的主要方法是采用抗痫药物治疗，但是仍有1/3的患者在使用抗痫药物治疗后不能有效控制发作，称为耐药性癫痫[2].因此，研究更有效的癫痫治疗方法是非常重要和迫切的.近年来的研究开始关注癫痫发作间期的高频震荡(high frequency oscillations，HFOs)[3]，发作间期HFOs出现的数量可以镜像反映癫痫发作程度，在临床应用上有可能作为一种有效生物标志物[4].HFOs分类两种类型：ripples(80～250 Hz)和fast ripples(250～500 Hz).Lin等发现让癫痫患者连续6个月每天聆听8 min莫扎特K.448能够降低癫痫样放电活性[5].随后他们进一步应用先天性自发癫痫模型鼠研究莫扎特K.448音乐治疗的作用，用，发现给予莫扎特K.448治疗后模型鼠发作频率和痫性放电程度降低[6].但是，音乐治疗对HFOs的作用尚无研究报告.本研究采用广泛应用的耐药性癫痫模型——匹罗卡品(pilocarpine, PILO)诱导的颞叶癫痫动物模型，在其慢性自发发作期(spontaneous recurrent seizure，SRS)给予莫扎特K.448音乐治疗，测试其对HFOs的影响.

1 材料和方法

1.1 实验动物

6 ～ 7周龄健康、普通清洁级C57BL/6 雄性小鼠，体重为20 ± 2 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供.实验动物购买后饲养在独立通风笼盒系统中适应环境2周，饲养房内白炽灯自动定时开关保证昼夜时间各12 h(00:00—12:00为白天，12:00—24:00为黑夜).

1.2 主要试剂和仪器设备

阿托品(atropine)、PILO均为美国Sigma公司；惊跳反射系统，美国，San Diego，SR-LABTM；Neurolog电生理记录系统，英国，CED，NL900D；模拟-数字转换器，英国，CED，1401 plus.

1.3 实验方法

1.3.1 建立癫痫持续状态(status epilepticus，SE)模型

将23只小鼠随机分为两组：实验组15只，对照组8只.实验组先给予1 mg/kg 阿托品预处理，以降低PILO引起的外周胆碱能效应，减少动物死亡.同时，对照组腹腔也注射同剂量的阿托品.30 min后，实验组腹腔注射匹罗卡品(PILO，300 mg/kg)，对照组注射等容量生理盐水.PILO处理后引起小鼠痫性发作级别根据Racine分级[7]的标准判定，见表1.SE标准设定为：给予PILO处理后1 h内发作级别达到4级以上并且累积发作时间超过30 min.小鼠达到SE标准即给予水合氯醛(150 mg/kg)腹腔注射终止发作.对照组也给予同剂量水合氯醛处理.

表1 Racine典型分级标准Tab.1 Racine’s classification

1.3.2 埋置电极

在SE后3周，利用脑立体定位仪对造模成功小鼠和对照组小鼠进行颅骨内埋置电极手术.在前囟后1.8 mm、左侧旁开1.4 mm处为记录电极位置；前囟前1.5 mm、右侧旁开1.5 mm处为参考电极位置.术后恢复1周即开始记录脑电(electroencephalogram，EEG).

1.3.3 听觉惊跳反射(acoustic startle response)实验

在SE后4周对小鼠(SE模型组8只，对照组8只)进行惊跳反射实验.将小鼠放入SR-LAB惊跳反射系统，适应5 min后，选用不同分贝的白噪音(0、70、80、90、100、110 dB)伪随机进行刺激，每个刺激给予10次，每次持续20 ms，2次声音刺激之间伪随机间隔5 ～ 15 ms.

1.3.4 音乐治疗实验

在SE后6～7周，对以上进行惊跳反射实验的所有小鼠播放莫扎特D大调双钢琴奏鸣曲K.448.播放时间在小鼠的夜间活跃期(17点至19点)，音乐时长24 min，每天连续播放2 h，声音强度为80 dB.每只小鼠连续接受2次音乐治疗.采用视频脑电检测系统在音乐刺激前记录3 h EEG，刺激中和刺激后分别记录2 h EEG.EEG测试使用Neurolog系统，采样率设置为2.5 kHz，滤波范围为0.1～500 Hz.

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 PILO腹腔注射成功诱发SE

PILO是乙酰胆碱能受体的激动剂.由于胆碱能受体广泛分布于心肌、窦房结、血管、白细胞和血脑屏障内皮细胞上，因此PILO能够强有力地影响外周器官、血管和血细胞循环，产生外周胆碱能效应及引起血脑屏障破坏，导致脑内神经元同步化异常放电，引起发作[8].本实验中15只小鼠腹腔注射PILO，成功诱发SE并存活的小鼠有8只，成功率为53.3 %;未达到SE并存活的有4只，死亡3只，死亡率为20.0 %.对照组所有小鼠中未出现痫性发作.

2.2 SRS期EEG活性异常

从SRS期EEG数据(0.1～500 Hz)中截取了发作间歇期对应的EEG，采用低频滤波和高频滤波处理的方法(FIR digital filtering)，对小鼠发作间歇期不同频率的EEG活性特征进行分析.低频滤波为10 Hz-传统概念上与痫性发作密切相关的震荡频率；高频滤波为50～80 Hz(γ活性)、ripples(80～250 Hz)和fast ripples(250～500 Hz).结果显示在发作间歇期高频(γ活性和ripples)范围内EEG活性异常，见图1.

2.3 SE模型小鼠的听力未受明显影响

惊跳反射是机体在响应突发性刺激时产生的一种复杂性反应.在惊跳反射实验研究中，最常用的诱发刺激为白噪声引起的惊跳反射[9].随机给予声音刺激的分贝越高，小鼠受到惊吓后脚底对仪器底座产生的压力越大，因此根据输出的相对压力值大小可判断小鼠的听力是否受到影响.结果显示：SE模型组与对照组相比，在不同分贝声音刺激时小鼠所产生的相对压力之间没有显差，表明两组小鼠对声音强度的敏感性相似(表2).

a：0.1～500 Hz；b：0.1～10 Hz；c：50～80 Hz；d：80～200 Hz；e：250～500 Hz.箭头表示滤波后不同频段EEG上与a图相对应的时间点，圆圈表示γ活性和高频振荡的脑电特征.

表2 不同分贝白噪音刺激时对仪器底座产生的相对压力值Tab.2 Pressure index induced by different white noises

2.4 莫扎特K.448对SRS期EEG活性的影响

通过对比分析SE模型组与对照组小鼠在音乐治疗前后功率能量的变化，发现音乐治疗后两组小鼠的EEG功率均在55～145 Hz范围内显著升高(F55～95 Hz= 136.387、F105～115 Hz= 26.690、F130～145 Hz= 41.201，P<0.001)，说明γ活性和ripple活性在音乐刺激后增强(图2、图3、图4).但是音乐刺激和分组之间的交互作用没有统计学差异(P> 0.05).由于仪器本身电噪音(50 Hz或60 Hz倍数)的影响，在50、100、120、150 Hz附近部分频率受到大的干扰，因此去除了相应的功率谱数据.因为输出结果较多，本文省略没有显著差异的频率范围的功率谱数据.

a. 不同分组之间功率谱能量的变化；b. 不同频率之间功率谱能量的变化.图2 55～95 Hz范围内刺激前后功率谱能量的变化Fig.2 The change of EEG power in 55～95 Hz

a. 不同分组之间功率谱能量的变化；b. 不同频率之间功率谱能量的变化.图3 105～115 Hz范围内刺激前后功率谱能量的变化Fig.3 The change of EEG power in 105～115 Hz

a. 不同分组之间功率谱能量的变化；b. 不同频率之间功率谱能量的变化.图4 130～145 Hz范围内刺激前后功率谱能量的变化Fig.4 The change of EEG power in 130～145 Hz

3 讨论

3.1 HFOs与癫痫

癫痫是一种具有神经元异常同步化放电现象的复杂性神经系统疾病，近年来许多研究表明HFOs有可能是癫痫的一种生物标记物[10].1999年，Bragin等人在颞叶癫痫患者和癫痫模型动物上检测到HFOs，认为这些HFOs是由病理网络互联的神经元产生强大的超同步放电引起的[11].在PILO诱导的颞叶癫痫动物模型研究中发现产生自发发作的脑区与HFOs活性紧密相关，发作起始区域内HFOs出现的比率越高，其产生癫痫发作的可能性越高[12].HFOs常与发作间期痫性放电(interictal epileptiform discharge)同时出现，并且发作间期HFOs能够响应抗痫药物的药量变化.抗痫药物减量后，发作间期HFOs与癫痫发作频率同时增加[4].移除产生HFOs的脑组织有较好的手术治疗效果，表明HFOs有潜在的临床意义，有可能发展为新的临床治疗靶点[13].本研究采用PILO诱导的SE模型模拟人类颞叶癫痫，在模型鼠SRS间歇期检测到HFOs，表明了SE模型后小鼠HFOs的EEG活性异常可作为PILO模型小鼠的癫痫活动指标之一.

3.2 音乐治疗与癫痫

音乐是人们日常生活当中的一部分，对于大多数人来说，音乐能够带来欢乐，美好的音乐可以调节情感，提升生活品质.音乐对大脑功能起着重要作用，比如能够提升语言记忆能力、改善认知功能[14].在很多神经系统疾病包括帕金森、阿尔茨海默病研究中都发现音乐对患者的治疗有帮助[15-17].“莫扎特效应”一词源于1993年Rauscher等人的经典实验研究：给正常测试者听10 min莫扎特K.448，测试者表现出空间推理能力显著提高[18].随后，一些研究者发现莫扎特K.448能够降低大部分癫痫患者癫痫样放电的频率，说明莫扎特K.448可能有助于癫痫的治疗.但是以上研究中的癫痫患者是在不改变抗痫药物治疗的情况下接受莫扎特K.448音乐治疗的，癫痫样放电活性的降低是音乐本身造成还是其与抗痫药物交互作用的结果并不清楚[5,19].本研究发现，在SE模型小鼠SRS期，连续2d 给予2 h的莫扎特K.448音乐治疗后， SE模型组和对照组的EEG功率在55 ～ 145 Hz范围内都显著升高，说明莫扎特K.448能够增强了脑内神经元同步化放电.但是功率谱能量的升高与小鼠是否经过PILO处理无关，这一实验结果表明莫扎特K.448的短期治疗对正常小鼠以及PILO模型小鼠可引起同样的EEG功率谱增强，而不是减弱.

4 结论

通过建立颞叶癫痫动物模型，首次在不给予抗癫药物治疗的前提下检测了莫扎特K.448对痫性放电活性的影响.结果表明，短时期给予莫扎特K.448音乐治疗没有降低痫性放电程度，反而增强了高频EEG活性.今后将对长时程音乐治疗对SE模型小鼠SRS期EEG的影响做进一步的研究，探索更为有效的治疗方法，帮助癫痫患者缓解疾病带来的痛苦，可能在癫痫治疗中有新的突破.