根结线虫侵染对不同抗性番茄品种叶片叶绿素含量及其荧光参数的影响

李媛媛 王冰林 钱 程 胡玉荣 郑慧敏

（1山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，潍坊学院生物与农业工程学院，山东潍坊 261061；2潍坊市农业科学院，山东潍坊 261071）

根结线虫是为害作物生产最严重的病害之一，能够侵染包括番茄在内的2 000多种植物（Vasyukova et al.，2009）。我国设施番茄栽培因为连作重茬、复种指数高等原因，根结线虫发生非常严重甚至成为流行性病害（李君明 等，2003；李红双 等，2006）。根结线虫侵染首先侵入植物根部伸长区，然后逐渐迁移至根部维管束，建立取食地点，破坏维管组织，从而影响植物根系对水分和营养的吸收（Abad et al.，2003）。Dorhout 等（1991）报道，根结线虫侵染导致番茄植株对水分的吸收减少，地上部出现生长迟缓、萎蔫及黄化现象。根结线虫侵染也会显著影响植物的保护酶活性、叶片水势、光合作用、呼吸作用、物质代谢等过程（Poskuta et al.，1986；Rahi et al.，1988；Ramakrishnan & Rajendran，1998；郭衍银 等，2005；李媛媛 等，2011；梁朋 等，2012；Strajnar et al.，2012；王冰林 等，2013）。虽然有关根结线虫侵染对植株生理生化特征的影响研究较多，但是根结线虫侵染后，番茄叶片叶绿素荧光参数的变化却鲜有报道。本试验以两个不同根结线虫抗性的番茄品种为试材，通过根结线虫侵染过程中叶片叶绿素含量和叶绿素荧光参数的变化，分析线虫侵染与叶片生理指标变化的关联性，为筛选抗根结线虫番茄品种提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试番茄（Solanum lycopersicumL.）品种为世佳101和精选红桃，由潍坊市农业科学院提供。经分子标记检测（Williamson et al.，1994），两个品种均不含Mi-1基因。供试南方根结线虫（Meloidogyne incognita）采自潍坊市农业科学院试验基地，经鉴定后，利用活体番茄苗保种、扩繁。

1.2 试验方法

1.2.1 世佳101和精选红桃根结线虫抗性鉴定 试验于2011年1～6月在潍坊学院试验基地日光温室中进行。用2%的NaClO溶液浸种30 min，对供试番茄种子进行消毒，用无菌水冲冼3次后，置于培养皿中30 ℃催芽。催芽后将其播种至内含蔬菜育苗专用基质的72孔育苗穴盘中进行正常培养。待幼苗长至三叶一心时移植于直径8 cm、高17 cm的塑料杯中，每杯1株，杯内栽培基质（砂∶土=1V∶ 2V）经过高温灭菌处理。

番茄苗长至四叶期后，选择长势相同且生长优良的植株，在根周围用打孔器打孔（每杯打5孔），注入根结线虫二龄幼虫（2 000条·杯-1），然后用土掩埋（李媛媛 等，2011）。两个品种各接种15株，以注入清水为对照，3次重复。培养40 d后，参照Garabedian和 van Grundy（1983）的分级标准，调查每株番茄苗的根结等级，计算病情指数，鉴定抗性等级（白春明 等，2010）。

1.2.2 叶绿素含量和叶绿素荧光参数的测定 试验于2012年1～6月在潍坊学院试验基地日光温室中进行。番茄苗培养和线虫接种均同1.2.1。两个品种各接种15株，以注入清水为对照，3次重复。分别在接种后 0、5、10、15、20 d和 25 d，利用PAM-2100型脉冲调制式叶绿素荧光仪测定番茄功能叶片的叶绿素荧光参数，包括最大光化学效率（Fv/Fm）、光合电子传递效率（ΦPSⅡ）和非光化学猝灭系数（NPQ）。测定结束后，选取相应节位的叶片保存于超低温冰箱中，用于测定叶绿素含量。用80%丙酮将叶片研磨、萃取、过滤定容后，以80%丙酮为对照，在紫外-可见分光光度计上分别测定OD663和OD645。叶绿素a （Chla） 和叶绿素b （Chlb）含量计算公式参考张志良等（2010），并分别计算Chl（a+b）含量和Chla/b值。

1.2.3 数据分析 数据处理和图形绘制采用Microsoft Excel 2003 软件，方差分析采用 SPSS 11.5软件。

2 结果与分析

2.1 番茄品种抗性鉴定

苗期接种鉴定结果表明：两个番茄品种存在明显抗性差异，世佳101根结等级为5.0，病情指数达到100，属于高感根结线虫品种；精选红桃根结等级为2.6，病情指数为40，属于中抗根结线虫 品种。

表1 根结线虫侵染对番茄叶片叶绿素含量的影响

2.2 南方根结线虫侵染对番茄叶片叶绿素含量的影响

如表1所示，在未接种的材料中，精选红桃的Chla含量比世佳101高15.7%，二者差异显著；接种根结线虫15 d后，与清水对照相比，两个品种的Chla含量均显著下降，但精选红桃下降幅度低于世佳101。两个番茄品种的Chlb含量在未接种的材料中差异显著。接种根结线虫后，精选红桃植株Chlb含量变化较小，差异均未达到显著水平；世佳101接种植株Chlb含量在接种20 d后开始显著降低，到接种25 d时，比清水对照降低26.9%。在未接种的材料中，两个番茄品种的Chl（a+b）含量不存在显著差异。在接种根结线虫20 d后，精选红桃植株叶片Chl（a+b）含量开始显著下降，而世佳101植株叶片在接种15 d后即开始显著下降。未接种材料的Chla/b值一直比较稳定，抗病材料精选红桃叶片Chla/b值是感病材料世佳101的1.43倍。线虫侵染后，两个番茄品种的Chla/b值呈现出不同程度的降低。以上结果表明，线虫侵染会导致番茄叶片叶绿素降解，但是抗性品种的叶绿素降解幅度显著低于高感品种，即抗性品种在线虫侵染后其叶绿素含量仍能稳定在较高水平，以尽可能维持正常的光合性能。

2.3 南方根结线虫侵染对番茄叶片叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数Fv/Fm反映了PSⅡ的最大光化学效率，是光抑制程度的一个重要指标。利用叶绿素荧光仪测得根结线虫侵染后番茄叶片Fv/Fm的变化趋势如表2。清水对照的两个番茄品种的 Fv/Fm一直恒定在0.81左右。线虫侵染前期，该参数变化较小，在接种20 d后，世佳101与清水对照相比显著下降；精选红桃则在接种后25 d才开始显著下降。以上结果表明，在接种后期两个品种均发生光抑制，且世佳101的光抑制强度更高。

叶绿素荧光参数ΦPSⅡ表示实际光化学效率，其值升高或降低反映植物光合碳同化的促进或抑制程度。在清水对照中，两个番茄品种的ΦPSⅡ在整个试验时期内不存在显著差异（表2）。在接种根结线虫前期，两个品种的ΦPSⅡ变化幅度较小。接种后15 d，ΦPSⅡ均开始显著下降，且世佳101下降幅度大于精选红桃；ΦPSⅡ到接种后25 d达到最低值，世佳101和精选红桃分别比清水对照下降26.0%和10.2%。结果表明，番茄叶片光合碳同化过程由于线虫的侵染出现了不同程度的抑制，并且世佳101的抑制程度大于精选红桃。

叶绿素荧光参数NPQ值的升高可以保护光合系统免受损害，以尽可能维持植物的光合性能。根结线虫侵染后，两个品种叶片的NPQ先呈现上升趋势，且精选红桃上升幅度大于世佳101，侵染10 d时两个番茄品种的NPQ出现显著差异；在接种25 d后NPQ突然显著下降，但精选红桃的接种植株叶片NPQ仍显著高于清水对照（表2）。

表2 根结线虫侵染对番茄叶片叶绿素荧光参数的影响

3 结论与讨论

根结线虫侵染番茄植株后，抗病品种和感病品种的叶绿素含量总体呈逐渐下降趋势，且抗病品种的降低幅度明显低于高感品种。同时，线虫侵染对番茄叶片叶绿素荧光特性造成明显影响。其中 Fv/Fm和ΦPSⅡ随着根结线虫侵染时间的延长呈现下降趋势，高感品种出现显著降低的时间要早于抗病品种，降低幅度也大于抗病品种。叶绿素荧光参数NPQ随根结线虫侵染呈现先上升再下降的趋势，抗病品种的上升程度大于感病品种，在接种10 d后，抗感品种的NPQ值出现显著差异。上述研究结果表明，线虫侵染后，中抗品种精选红桃能够保持较高的叶绿素含量，光抑制和碳同化过程受影响较小，且热耗散能力较强，从而使精选红桃植株生长受线虫侵染影响较小。

本试验发现，根结线虫侵染导致两个番茄品种的叶绿素含量下降，与前人的研究结果基本一致（Wang et al.，2004；Bilgin et al.，2010；叶德友 等，2011；Korayem et al.，2012）。高感根结线虫品种世佳101叶绿素含量降低幅度明显高于中抗品种精选红桃，也与前人的研究一致。叶德友等（2011）发现线虫侵染后抗病材料叶绿素含量的降低幅度显著小于感病材料。Chaerle等（2007）认为通过监控被病菌侵染后植物叶片叶绿素含量的降低程度可以反映植物对病原菌的抗性程度，从而实现对抗、感植株的筛选。

测定叶片叶绿素含量会对植株造成一定损伤，且程序繁琐，应用叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数的变化，可以实现对植株叶片光合性能的无损检测。本试验测定了根结线虫侵染过程中不同抗性番茄品种的叶绿素荧光参数的动态变化。其中，Fv/Fm表现最稳定，在接种早期基本恒定在0.81左右，直到接种20 d后高感品种才出现显著下降。Rahi等（1988）研究表明，线虫侵染会损伤植物根系，影响植株水分吸收，形成叶片生理性缺水，致使叶片气孔部分关闭。Baker和Rosenqvist（2004）认为水分胁迫早期叶片气孔的部分关闭会导致CO2的吸收量减少，影响光合作用的暗反应，但不会影响PSⅡ，因此Fv/Fm变化不大；水分胁迫后期，水分的进一步匮缺会导致Fv/Fm出现下降趋势（Jansen et al.，2009；Mishra et al.，2012）。ΦPSⅡ和NPQ在接种初期基本保持稳定，可能意味着叶片吸收的光能能够被暗反应和光呼吸作用完全利用（M ü ller et al.，2001；Ort & Baker，2002）。Omasa和Takayama（2003）研究报道，无论气孔关闭与否，NPQ和ΦPSⅡ都不会发生改变，但如果在强光照射下NPQ和ΦPSⅡ会出现明显的上升和下降趋势。本试验中，与清水对照相比，番茄植株叶片自接种后15 d开始，ΦPSⅡ出现了显著下降；NPQ则分别在接种10 d（精选红桃）和15 d（世佳101）后出现了显著上升，可能表明叶片吸收的光能不能够被CO2固定和光呼吸途径充分利用，非光化学机制被快速启动。NPQ值的升高可以保护光合系统免受损害，以尽可能维持植物的光合 性能。

大量研究表明，叶绿素荧光参数能够稳定遗传， 并 且 前 人 已 在 小 麦（Czyczyło-Mysza et al.，2013）、玉米（Šimić et al.，2014）等作物中对叶绿素荧光参数进行了QTL定位，开展了相关分子基础等方面的研究。综合本试验结果，通过检测叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSⅡ和NPQ的变化，可以无损、便捷地提供番茄抗感根结线虫的相关信息，并且由于NPQ在接种材料中出现差异的时间最早，因此NPQ可能是一个更适合于在田间无损检测番茄抗感根结线虫材料的叶绿素荧光参数。但叶绿素荧光参数的测定受诸多因素影响，因此关于NPQ的田间适用性还有待于进一步试验研究。

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