决明子提取物减轻2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤

刘利兵，张海锋

(1.西京学院 医学护理教研室， 陕西 西安 710123； 2.第四军医大学 教学实验中心，陕西 西安 710032)



研究论文

决明子提取物减轻2型糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤

刘利兵1*，张海锋2*

(1.西京学院 医学护理教研室， 陕西 西安 710123； 2.第四军医大学 教学实验中心，陕西 西安 710032)

目的研究决明子提取物(SCE)对糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的影响。方法构建高脂饲料-链脲霉素诱导的2型糖尿病大鼠模型(HFD-STZ)，大鼠随机分为对照组(Con)、SCE处理组(Con+SCE，每日灌胃给予SCE，10 mg/kg)、糖尿病组(DM)和糖尿病SCE处理组(DM+SCE)。1周后行心肌缺血30 min/再灌注4或6 h，并检测血浆总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)水平，用伊文氏蓝-TTC法检测心肌梗死范围、用试剂盒检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性、用TUNEL法和caspase- 3试剂盒检测细胞凋亡，用Western blot法检测Akt、ERK1/2表达及磷酸化等。结果HFD-STZ大鼠MI/R损伤加重，虽SCE处理1周对正常动物MI/R损伤无影响，但降低HFD-STZ大鼠TC、TG水平，可将其心肌梗死面积减小至38.4%±2.7%，显著低于糖尿病组的46.1%±3.2%(P<0.05)，且血清CK、LDH活性及细胞凋亡减少；还可增加HFD-STZ大鼠心肌Akt及ERK1/2磷酸化。用Akt或ERK1/2抑制剂可阻断SCE的心肌保护作用。结论SCE可有效减轻糖尿病大鼠MI/R损伤，可能与其降脂并激活Akt及ERK1/2信号有关。

决明子；糖尿病；心肌缺血/再灌注损伤；Akt；ERK1/2

糖尿病是心血管疾病的主要危险因素之一，2型糖尿患者患缺血性心脏病(ischemic heart disease, IHD)的风险是非糖尿病患者的2～4倍，且糖尿病患者发生心肌梗死后的病死率更高[1]。已证实在Zucker肥胖大鼠，缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion, MI/R)所诱导的心肌细胞凋亡明显高于对照组，提示糖尿病状态下缺血心肌易损性增加。

近年，中草药及其活性成分在防治心血管病中的作用受到重视。决明子(semen cassiae，SC)在中医实践中用于预防和治疗高脂血症及减肥等[2]。其提取物(semen cassiae extract，SCE)可显著降低高脂血症模型的血浆低密度脂蛋白(LDL)及三酰甘油(TG)水平，并升高高密度脂蛋白(HDL)水平[3]。从SC提取的可溶性纤维可降低高质饮食诱导的肥胖模型的血浆及肝脏的脂质水平[4]。临床研究还显示他汀类及贝特类降脂药可降低心血管事件的危险度[5]。然而，同样有降脂效应的SCE对MI/R心肌损伤、尤其是糖尿病状态下的心肌损伤的影响尚不清楚。本研究拟观察SCE对正常和糖尿病大鼠MI/R损伤的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

链脲霉素(STZ，Sigma公司)，决明子(SC)由第四军医大学药物研究所鉴定，水煎液冻干粉占初始物的提取率约为3.9%。胰岛素放射免疫分析试剂盒、血清三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)试剂盒(北京北方生物技术研究所)。肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒(南京建成公司)。原位末端转移酶标记法细胞凋亡试剂盒(TUNEL，Roche公司)，caspase- 3试剂盒(Chemicon公司)。Akt、pAkt、ERK1/2和pERK1/2抗体(Cell Signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 构建2型糖尿病大鼠模型：用高脂饲料-STZ法诱导，空腹血糖≥16.7 mmol/L为2型糖尿病模型构建成功[6]。

1.2.2 实验分组：大鼠随机分为对照组(con)、SCE处理组(con+SCE)、糖尿病组(DM)和糖尿病SCE处理组(DM+SCE)，每组例数=8。SCE处理为持续1周每天灌胃(10 mg/kg，悬浮于0.9%氯化钠注射液)[7]。1周后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg)，常规制备大鼠MI/R模型，心肌缺血30 min后再灌注4 h，检测心肌损伤及信号分子。为研究SCE的作用机制，用PI3K特异性抑制剂wortmannin(1.4 mg/kg, i.p.)或ERK1/2特异性抑制剂PD98059(5 mg/kg, i.p.)在缺血前15 min预处理，再观察心肌损伤及信号分子。

1.2.3 细胞凋亡和心肌梗死检测：分别按照TUNEL和caspase- 3试剂盒说明书检测心肌TUNEL阳性细胞与caspase- 3活性，用伊文氏蓝-TTC法检测心肌梗死范围[8]。

1.2.4 血浆TC和TG水平、血清CK和LDH活性检测：按照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血糖、血胰岛素、总胆固醇、三酰甘油水平及体质量

与正常组相比，HFD-STZ大鼠空腹血糖明显升高(≥16.7 mmol/L)，血浆TC和TG增高，TC：(4.63±0.10)mmol/Lvs(1.57±0.12)mmol/L，与对照组相比(P<0.01)；TG：(1.13±0.08)mmol/Lvs(0.68±0.09)mmol/L，与对照组相比(P<0.05)，体质量下降(220±16)gvs(272±18)g，与对照组相比(P<0.05)，SCE处理1周可显著降低HFD-STZ大鼠TC和TG水平，分别为(2.10±0.13)mmol/L与(0.85±0.06)mmol/L，与糖尿病组相比(P<0.05)。

2.2 SCE促进糖尿病大鼠MI/R后心脏功能恢复和减轻心肌损伤

与对照组相比，DM大鼠在再灌注末左室压最大上升与下降速率(±LVdP/dtmax)明显降低,+LVdP/dtmax：(2 937±85)mmHg/svs(3 329±111)mmHg/s(1 mmHg = 0.133 kPa)；-LVdP/dtmax：(2 453±72)mmHg/svs(2 670±70)mmHg/s；与对照组相比(P<0.01)。而SCE处理1周对正常大鼠的上述指标无明显影响，但可显著增高DM大鼠的±LVdP/dtmax,+LVdP/dtmax：(3 207±96)mmHg/s，与糖尿病组相比(P<0.05)；-LVdP/dtmax：(2 733±73_mmHg/s，与糖尿病组相比(P<0.01)。

与对照组相比，MI/R可使DM大鼠出现更大的心肌梗死范围，更高的CK和LDH活性(表1)，且凋亡指数AI和caspase- 3活性也较高(图1)。SCE处理1周对正常大鼠的上述指标无明显影响，但可显著减少DM大鼠的心肌梗死范围，降低血浆CK、LDH活性，抑制心肌细胞凋亡和caspase- 3活性。

表1 大鼠心肌梗死范围、血浆肌酸激酶与乳酸脱氢酶活性

INF.infarct size; AAR.area at risk; CK.creatine kinase; LDH.lactate dehydrogenase;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM.

A.top: representative photomicrographs of terminal deoxynucleotidyl nick-end labeling (TUNEL) staining in ischemic heart tissue(×400); bottom:percentage of TUNEL-positive nuclei; B:myocardial caspase- 3 activity;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM

图1 SCE预处理减少糖尿病大鼠MI/R诱导的心肌细胞凋亡

2.3 SCE减轻糖尿病大鼠MI/R损伤的分子机制

与对照组相比，DM组心肌Akt及ERK1/2磷酸化明显减少(P<0.05)(n=3)。SCE处理1周对正常大鼠的上述指标无明显影响，但可显著增加DM大鼠的Akt及ERK1/2磷酸化(图2)。用PI3K抑制剂wortmannin或ERK1/2抑制剂PD98059在分别抑制Akt或ERK1/2磷酸化的同时，可阻断SCE降低DM大鼠心肌caspase- 3活性与血浆CK、LDH活性的作用(图3)。

3 讨论

中药决明子(SC)有清肝明目作用，也用于降脂、治疗头疼及头晕等[9]。新近研究者采用高效液相色谱法(HPLC)提取了SC的有效成分，并绘制了指纹图谱。所提取的13种含量较高的有效成分，其中11种是蒽醌类，包括大黄素甲醚、大黄素、大黄酚、大黄酸、芦荟大黄素、橙黄决明素等[10]；这些成分也是研究最多的SC有效成分，被广泛报道。其他的成分还有萘并吡喃酮类、脂肪酸、氯基酸类等。通过对提取剂乙醇浓度、固液比、浸提时间、浸提温度、浸提次数进行单因素梯度实验，观察了多种提取方法对SC中蒽醌、多糖和黄酮提取率的影响，实验表明SC的总的提取率较低，最大提取率为0.35%，用乙醇提取SC中有效成分蒽—醌远低于水提取物，提示单就蒽醌一种有效成分最好采用水提取的方法。因此，水提法被广泛用来提取SC有效成分并研究其药效。水提法提取的SCE有神经保护作用，可减少小鼠脑缺血引起的记忆障碍和神经损害[7]，且SCE可减轻钙转运障碍和减少神经细胞死亡[11]。SCE对MI/R心肌损伤、尤其对糖尿病时的心肌损伤的影响尚无报道。本研究发现SCE可减少糖尿病大鼠MI/R诱导的心肌损伤和促进心功能恢复。细胞凋亡在MI/R诱导的心肌损伤中发挥重要作用，心肌缺血可促发细胞凋亡，而再灌注可使凋亡大幅增加[11]。Zucker糖尿病大鼠MI/R诱导的心肌细胞凋亡显著增加，提示糖尿病可加重心肌损伤[12]。SCE可降低6-羟多巴胺处理的PC12细胞的caspase- 3活性[13]。本研究证实SCE处理1周可减少糖尿病而非正常大鼠MI/R诱导的心肌细胞凋亡指数，并降低caspase- 3活性，还可降低糖尿病大鼠TC及TG水平，提示SCE对糖尿病缺血心肌的保护作用可能是基于其抗凋亡效应及降脂作用。

PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号是重要的促细胞生存的通路，增加Akt和ERK1/2磷酸化可介导细胞增殖、促生存并减轻MI/R损伤[14]。与文献报道一致，笔者也观察到Akt和ERK1/2磷酸化在糖尿病状态减弱[15]。

A.representative blots of total and phosphorylation of Akt in heart tissue from rats subjected to MI/R; B.ERK1/2;*P<0.05 compared with con;#P<0.05 compared with DM

图2 SCE预处理增加糖尿病大鼠缺血心肌的Akt和ERK1/2磷酸化

Fig 2 Total and phosphorylated of Akt and ERK1/2 levels and the modification by SCE treatment (n=3)

A.representative blots of total and phosphorylation of Akt in heart tissue from rats subjected to MI/R; B.ERK1/2; C.myocardial caspase- activity; D.Plasma CK and LDH activities;*P<0.05 compared with MI/R;#P<0.05,##P<0.01 compared with SCE

图3 SCE预处理通过激活Akt和ERK1/2保护糖尿病大鼠缺血/再灌注心肌

Fig 3 SCE attenuated MI/R injury in diabetic animals via activation of Akt and ERK1/2 (n=3)

SCE可显著恢复糖尿病心肌的Akt和ERK1/2磷酸化，且PI3K抑制剂wortmannin或ERK1/2抑制剂PD98059在抑制Akt或ERK1/2磷酸化的同时，可阻断SCE降低细胞凋亡与血浆CK及LDH活性。提示，SCE可通过激活PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路保护糖尿病缺血心肌。Akt和ERK1/2可通过调节抗凋亡和促凋亡蛋白和转录因子来促细胞生存，促凋亡分子Bcl- 2家族成员BAD可在Akt的Ser136和ERK1/2的Ser112位点磷酸化后被调节失活。

总之，SCE可显著促进糖尿病大鼠MI/R心功能恢复、减轻心肌损伤和凋亡，其机制可能与其降脂效应及激活Akt和ERK1/2通路有关。决明子可能作为降低糖尿病患者缺血心肌易损性、改善预后的候选药。

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研究人员还发现，如果洗手台很肮脏，人们就不太爱洗手；反之，人们则会拉长洗手的时间。

Semen cassiae extract attenuates myocardial ischemia and reperfusion injury in type 2 diabetic rats

LIU Li-bing1*, ZHANG Hai-feng2*

(1.College of Nursing, Xijing University, Xi’an 710123; 2.Experiment Teaching Center, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

Objective Obese patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) characterized by hyperglycemia are liable to more severe myocardial infarction. Semen Cassiae is proved to reduce serum lipid level. This study was to investigate whether the Semen Cassiae extract (SCE) reduces myocardial ischemia and reperfusion (MI/R) injury with or without diabetes and the underlying mechanisms. Methods The high-fat diet-fed streptozotocin (HFD-STZ) rat model was used as T2DM model. Normal and DM rats

SCE treatment orally(10 mg/kg/day) for 1 week. Subsequently these animals were subjected to MI/R. Results Compared with the normal animals, DM rats showed increased plasma total cholesterol (TC) and triacylglycerol (TG), more severe MI/R injury and cardiac functional impairment. SCE treatment significantly reduced the plasma TC and TG, improved the instantaneous first derivation of left ventricle pressure and reduced infarct size, decreased plasma creatine kinase and lactate dehydrogenase levels, and reduced apoptosis index at the end of reperfusion in diabetic rats. Moreover, SCE treat- ment increased the antiapoptotic protein Akt and stimulated ERK1/2 phosphorylation. Pretreatment with a PI3K inhibitor wortmannin or an ERK1/2 inhibitor PD98059 not only blocked Akt and ERK1/2 phosphorylation, but also inhibited the cardioprotective effects of SCE. However, SCE treatment did not show any effects on the MI/R injury in the normal rats.Conclusions SCE effectively improves myocardial function and reduces MI/R-induced injury in diabetic but not normal animals, which is potentially attributable to the reduced TC/TG levels and the triggered cell survival signaling Akt and ERK1/2.

semen cassiae; diabetes; myocardial ischemia/reperfusion injury; Akt; ERK1/2

2014- 05- 06

2014- 07- 18

国家自然科学基金 (81270330)；陕西省科学技术研究发展计划(2013KJXX-89)

1001-6325(2015)01-0001-06

R331.3

A

*通信作者(corresponding author)：liulibing@163.com; hfzhang@fmmu.edu.cn